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(無題) 削除/引用 No.2134-10 - 2008/10/20 (月) 12:40:56 - M みなさま、アドバイスありがとうございます。 超遠心はラージスケールでも出来るので、今度はそちらでやってみようかと思います。 超遠心でタイターが落ちることはないと知って安心しました。 レンチウィルス初心者ということで、どこかでミスがあったのかもしれません。 もっと検討を重ねてみたいと思います。 また、カラムを用いて濃縮という方法もあるようですが、自分としては293Tの培地を完全に除去したいという事情があるので、遠心で何とかならないかと考えています。

(無題) 削除/引用 No.2134-9 - 2008/10/20 (月) 08:57:04 - あ 私は、0.22μｍのフィルターをかけていますが、Dさんと同じく、超遠心をかける前よりも回収率（タイター）が下がることはありません。 ちなみに40mlを遠心して、濃縮後は100μから150μℓくらいにします。 遠心は、Dさんと同じ条件です。 それで、大体10^9くらいにはなります。 インサートが大きくて、タイターが上がらない時には、10cmディッシュを24枚使用して、2回超遠心をかけてタイターをあげたこともあります。 ペレットは遠心後すぐに懸濁分注をしないで、４度で数時間（オーバーナイトくらいまで）おいてから、懸濁しています。 （その方が、ペレットが緩むので懸濁しやすいからだそうです。）

濃縮ミスなのか？ 削除/引用 No.2134-8 - 2008/10/20 (月) 02:23:09 - D 肉眼で緑に見えるのは強いプロモーターを使っているからで IRES-GFPのような場合にはせいぜいほのかに程度です 0.45フィルターは自分も通していますが 細胞レベルは除去できてもタンパクは完全に除去できないので GFPの発現が強いとフィルターしても緑に見えるときはハッキリ見えます 自分の場合TFしてから回収するまで結構時間が長いのと 1つにつき30mlを濃縮できるからでしょう タイターは論文のために一応測っていますが 超遠心でどの程度落ちるかとか 凍結融解でどうなるかとか そんな無駄なことはもちろんしていません ウイルス屋ではないので使っているだけです 強制発現の場合insertサイズが少し大きくなると ウイルスタイターががた落ちします パッケージング効率が落ちるからです ただMさんの場合は濃縮前はウイルスはできているようですから そうではないとすると 単に濃縮の問題ということになりますよね VSVGじゃないと超遠心するとウイルスが壊れるとかいう デマっぽいウワサを聞かされた事がありますが （自分はレトロもレンチもenvの種類に関わらず10万Gぐらいで1.5hで濃縮してます） そういう弱いものも実は本当にあったりするんでしょうかね 単純にもっと枚数増やすか何かで スケール大きくすればできる気がしますけど 超遠心のローターは小さいスケールしかできないものですか？ 自分はやったことありませんが カラムで濃縮するものも結構濃縮できると聞いたことがあります 自分はタイター上がらないとかウイルスできないという相談は受けたことありますが 濃縮しないで使えるほどのウイルスできていて濃縮できないというのは初めて聞いたので これ以上アドバイスはできないと思います

(無題) 削除/引用 No.2134-7 - 2008/10/19 (日) 20:23:46 - あ Supをフィルターにかけてから遠心していますが、その場合10cmでぃっしゅ4枚で透明な2-3mmくらいのペレットが見えます。 フィルターをかけないで遠心すると、不透明な比較的大きなペレットが見えます。この場合だと、つよいGFP発現のあるレンチの場合ならペレットは緑色に見えます。 緑色に見えるのは、ウィルスそのものの色ではなく、細胞の破片などのゴミと一緒にGFPが混ざっているものが見えるので、フィルターでデブリを取り除けば、色はついて見えません。 また、遠心後にペレットを懸濁する際に強く泡立ててしまったりするとしんでしまうようです。 比較的弱いウィルスなので、遠心中から懸濁、分注するまで低温に保ち、長時間保存する場合にはー80度で凍結保存をした方が良いようです。

(無題) 削除/引用 No.2134-6 - 2008/10/18 (土) 21:26:14 - - フナコシからPeg-itというPEGを使って濃縮させる製品がでています。 超遠心ではなく普通の遠心で濃縮できます。 使ってみた印象はそれほどtiterは落ちることなく濃縮されているようです。 ご参考まで。

(無題) 削除/引用 No.2134-5 - 2008/10/18 (土) 15:24:43 - M GFPを発現するベクターを使っているのですが、Dさんのおっしゃるような「肉眼で細胞が緑色に見える」ということはありませんでした。 ということは、そもそも293がウィルスを十分に作っていなかったということになるのでしょうか。 継代数の比較的多い293Tを使っているため、状態があまりよくなかったのかもしれません。 さらに教えていただきたいのですが、遠心をすると回収率はどれくらいに落ちるのでしょうか？ また、ウィルスを一度凍結融解すれば、タイターはどれくらい落ちるのでしょうか？ 今後の参考にさせていただきたので、教えていただけると助かります。

(無題) 削除/引用 No.2134-4 - 2008/10/18 (土) 14:01:13 - Lenti 俺も10cm dishで培養したらペレット見えますよ。

ペレット 削除/引用 No.2134-3 - 2008/10/18 (土) 01:37:27 - D 必ずしもペレット＝ウイルスではないですが ペレットは一応の指標にはなると思います 293Tの状態が良く ウイルスを沢山作っている時はペレットもしっかりできます GFPなんかをレポーターに発現するようなベクターの場合 ペレットが緑色になったり そもそも培養している293Tが肉眼で緑色に見えるぐらいになったり 超遠心する前から培養上清がほのかに緑になったりします 恐らくそういったタンパク質などがアグって沈殿したものが ペレットとして見えているんだと思います 自分はT175のフラスコとか15cm dishの293Tの30 mlのメディウムを超遠心して直径5-7 mmぐらいのペレットが見える感じです 少し自分はTF後の培養期間が長いのでペレットが他人より多いと思います

(無題) 削除/引用 No.2134-2 - 2008/10/17 (金) 20:58:04 - とも その量じゃペレットは見えません。

レンチウィルスの濃縮 削除/引用 No.2134-1 - 2008/10/17 (金) 15:14:06 - M レンチウィルスの濃縮に関して質問があります。 超遠心（または遠心）をして濃縮する際にペレットは見えるものでしょうか？ 前回行ったときにペレットが見えず、チューブの底にウィルスがあると信じて上清を除去したのですが、案の定、タイターがずいぶん低くなってしまいました。 10cmdish一枚（10ml）を遠心しました。 293Tへのトランスフェクション効率はほぼ100％だったと思います。 レンチウィルスの濃縮をされたことのある方、ぜひ教えてください。 よろしくお願いします。

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