Bio Technical フォーラム

  • 書き込みがかなり増えてしまいサーバーの負荷が大きくなったので、新しいBioTechnicalフォーラムに移行してください。
  • 新しいトピックは新フォーラムでのみ立ち上げ可能です。レスは2009年2月15日までつけられますが、その後は、つけられません。

トピック一覧　|　研究留学ネットに戻る

最新のフォーラム　|　このフォーラム（readのみ）　|　ひとつ前のフォーラム（readのみ）

このスレッドをはてなブックマークに追加このスレッドをはてなブックマークに追加

マウス　骨の薄切 トピック削除
No.2130-TOPIC - 2008/10/16 (木) 15:06:11 - るう
現在、マウスの足関節の薄切を行っています。
パラフィン浸透後にEDTAによる脱灰、そしてパラフィンブロックの行程をえて、薄切時には表面脱灰もします。
ところが、せっかく切った切片が、伸展の際に、パラフィンが伸びるのに引っ張られるかのようにして骨組織がバラバラになったり、HEで見ると中央の部分だけが壊れていたり、、、という問題が生じています。伸展器やお湯の温度が高いのかと思い少し下げても同じでした。
手技が十分ではないこともありますが、パラフィン浸透や脱灰が不十分なのではとも考えられます。
よい方法はないものでしょうか。
　
- このトピックにメッセージを投稿する -



全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用
No.2130-7 - 2008/10/17 (金) 19:46:55 - 組織
> 20%ホルマリンで1週間ほどの固定（単に漬けっぱなしという感じ）
> 10% 2Na EDTA (pH7.0)にて室温で揺らしながら10日ほど脱灰
マウスの関節だとかなり小さいでしょうから、固定や脱灰の時間は十分すぎるほどだと思います。
これだけ浸ければ、ある程度切れそうな気がしますが。。

固定前に、組織は小さくしてますか？
まあマウスなので、あまりトリミングの必要はないかもしれませんが、念のため。

他の方が言われているように、硬組織と軟組織が入り交じってる分、切りにくいというのはあるかもしれません。
可能なら、切片を少し厚くしてみたらどうですか。硬くなって逆に切りにくい可能性もありますが。

(無題) 削除/引用
No.2130-6 - 2008/10/17 (金) 10:37:28 - るう

> > パラフィン浸透後にEDTAによる脱灰、そしてパラフィンブロックの行程をえて、薄切時には表面脱灰もします。
> 見逃してましたが、この手順で合ってますか？
> 通常は、固定→脱灰→パラフィン包埋だと思いますが。。

ご指摘のとおり、書き間違えていました。正しくは、固定→EDTAでの脱灰→パラフィン包埋　　の順です。

20%ホルマリンで1週間ほどの固定（単に漬けっぱなしという感じ）
10% 2Na EDTA (pH7.0)にて室温で揺らしながら10日ほど脱灰
その後、2日かけての脱水〜パラフィン浸透まで
といった行程です。
一応、針等で刺して脱灰の確認をしていますが、
薄切時に刃にあたるいうことは十分ではないということなのでしょうね。
伸展時の温度も、伸展器・お湯ともに40℃前後に下げて行っています。

シートチップ 削除/引用
No.2130-5 - 2008/10/16 (木) 21:06:50 - まうす
マウスの足の関節みたいに複雑な組織の薄切って難しいんですよね。
僕はパラフィン薄切はヘタクソなので、反則技を使っています。http://www.watson.co.jp/pdf/k5p.pdf
このシートチップを用いた方法で、HEと免疫組織染色は問題なく行えました。
コツは、シートチップを貼付けた後の薄切は、スパッと思い切って早く切ることです。普通は骨は、硬組織と軟組織の剥離を防ぐためにゆっくり切ったりしますが、シートチップを使う場合、ゆっくり切ると切片にしわが出来てしまいますので、早く切るようにしています。

おススメ脱灰液 削除/引用
No.2130-4 - 2008/10/16 (木) 17:46:07 - 千
「固定後」に、10%クエン酸Na22.5%ギ酸水溶液で、室温にて一晩脱灰するのがいいですよ。マウスの大腿骨もこれくらいの時間で薄切できるようになります。
脱灰液の後は、軽く水洗後、通常の操作でパラフィン包埋してください。

(無題) 削除/引用
No.2130-3 - 2008/10/16 (木) 17:05:44 - 組織
> パラフィン浸透後にEDTAによる脱灰、そしてパラフィンブロックの行程をえて、薄切時には表面脱灰もします。
見逃してましたが、この手順で合ってますか？
通常は、固定→脱灰→パラフィン包埋だと思いますが。。

(無題) 削除/引用
No.2130-2 - 2008/10/16 (木) 16:48:28 - 組織
なんとなく固定不十分のような気がしますが、一通り手技をチェックした方がいいかもしれませんね。
・固定液の種類、固定温度と時間
・脱灰の組成と脱灰時間
を教えて下さい。

伸展時の温度ですが、一般的にはお湯が40-45℃、伸展器が45-50℃くらいじゃないでしょうか。
ただしお湯の温度をあまり上げると、切片が崩れやすいので、私は40℃くらいでやってます。
あと、十分脱灰できていて、スムーズに薄切できるなら、表面脱灰しなくてもいいと思います。

マウス　骨の薄切 削除/引用
No.2130-1 - 2008/10/16 (木) 15:06:11 - るう
現在、マウスの足関節の薄切を行っています。
パラフィン浸透後にEDTAによる脱灰、そしてパラフィンブロックの行程をえて、薄切時には表面脱灰もします。
ところが、せっかく切った切片が、伸展の際に、パラフィンが伸びるのに引っ張られるかのようにして骨組織がバラバラになったり、HEで見ると中央の部分だけが壊れていたり、、、という問題が生じています。伸展器やお湯の温度が高いのかと思い少し下げても同じでした。
手技が十分ではないこともありますが、パラフィン浸透や脱灰が不十分なのではとも考えられます。
よい方法はないものでしょうか。
全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を チェックした記事を