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(無題) 削除/引用 No.2129-5 - 2008/10/17 (金) 10:07:51 - おお GFPのダイマーになる傾向を利用して、分子内のN末とC末のGFP変異体が相互作用しFRETを起こすように設定する系と、 ダイマーになる傾向が無視できるようにミューテーションを入れて、純粋に距離と角度の変化をモニターする系があるそうです。 そのターゲットの立体的な構造は分かっているのでしょうか?N末とC末の相対的な位置を把握するとイメージが浮かびやすいと思いますが、、、

(無題) 削除/引用 No.2129-4 - 2008/10/17 (金) 09:57:02 - FRET Ａ様 やはりそう簡単にはできそうではありませんね。 もっと詳しく検討していきたいと思います。 >[Re:2] あべちゃんさんは書きました : > http://www.path1.med.kyoto-u.ac.jp/mm/phogemon/ > かなり親切に解説されております。 とても参考になるサイトのご紹介ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.2129-3 - 2008/10/16 (木) 17:18:39 - A 別のin vitro系の実験でCFPとYFPの組み合わせでFRETの検出を 行ったことがあります。すいませんが詳細についてはここに書けません。 >我々のラボにはリンカーの長さをどうするといったノウハウはありません。 リンカーの長さについては短ければ短いほど（CFPとYFPが近ければ近いほど）強いシグナルが得られるというだけでどのような検出システム（検出器の感度や使うフィルターの種類）によってかなり異なってくるはずです。ですからFRETさんが使う機器によるとしかいえません。また融合させる目的タンパク質の性質にもよるかもしれません。ですからこの質問にお答えするのはかなり難しいかと思います。またこのタンパク質が細胞内でどれぐらい発現するのかによって分子内、分子間の２つのFRETが起こる可能性が考えられますがその辺りはどうでしょうか。 もし私がFRETさんの立場でその実験を行うのであればまずは細胞内での目的タンパク質の濃度（特定の細胞内小器官にしか発現しないのであれば小器官内での濃度）をなんらかの形で推定し、リコンビナント目的タンパク質（CFPとYFPを含む）を準備してin vitro系で期待しているシグナルが得られるのか（そのためにはin vitro系で目的タンパク質の構造変化を起こすことが必要）確認する必要があるかと思います。この辺りのハードルについて状況を再確認して指導教官やラボの人たちと話し合われては如何ですか。

(無題) 削除/引用 No.2129-2 - 2008/10/16 (木) 17:01:54 - あべちゃん http://www.path1.med.kyoto-u.ac.jp/mm/phogemon/ かなり親切に解説されております。 日本のFRETの権威、松田先生と宮脇先生に関してお勉強される事を強くお勧めいたします。

初心者のFRET 削除/引用 No.2129-1 - 2008/10/16 (木) 14:01:29 - FRET FRET（Fluorescence Resonance Energy Transfer）を行うかどうか考えています。 方法としては目的タンパク質のＮ末、Ｃ末にCFP, YFPを付けて、細胞に導入後、刺激に応じて蛍光を検出できるかどうかをモニターできる系を作るためです。 少なくともその目的のタンパク質は刺激に対して、立体構造変化することはわかっています。 プラスミドのコンストラクトを作成することや、細胞の蛍光観察などは問題ないのですが、我々の研究室ではＦＲＥＴを全く行ったことがありません。 聞いた話では目的にかなった良いFRETコンストラクトを作成するには最終的に１００個ほどはコンストラクトを作成すると聞いたことがあります。それでも駄目なものは駄目らしいとも聞きました。 我々のラボにはリンカーの長さをどうするといったノウハウはありません。 そのような初心者がFRETを行うのはやはり大変でしょうか？ どなたか経験のある方、教えてくださると助かります。

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