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(無題) 削除/引用 No.2128-8 - 2008/10/17 (金) 17:18:13 - antibo APさん アドバイス、ありがとうございます。 > オクタロニーは抗体の特異性とか、交差性を見るのにはいいと思いますが、力価の評価にはELISAのほうがいいのではないでしょうか。定量的な測定値がでますし検量線も描けます。 そうですね。 オクタロニーは時間がかかりますが、簡易的で、数種類のパターンを一気に振れるという利点があるので、重宝していますが、メジャーな方法で、そして感度が良いELISAだと、正確な力価を見定めることができそうですね。 ウェスタンだと、系を振るにも何回かやらなければいけないですからね･･･ > 私は、この値がほぼ一定に保たれる希釈率の限界を力価の目安にしています。 教授がオクタロニーの結果を見たとき、先のコメントにも書きましたが、抗原と抗血清のウェルの真ん中に形成された（抗原と抗血清の拡散状態が同じ）ときの抗血清の希釈倍率を気にしてましたからね。 これに相当するのかもしれない、と感じました。 このときの抗血清の希釈倍率の逆数を使って、EcoRIさんがアドバイスしてくださった感じで、表記するとGoodかもしれませんね。 > だいたい市販品でも力価をELISA 1:5000とか1:10000とかで表記されています。ジャクソンだったかどこかのガイドには、おおよその目安として、Westernでは10倍程度、免疫組織染色では100倍程度、表記のELISA希釈率より濃くして使えというようなことが書いてあったと記憶します。 さすがにELISAにより決定した力価ですと桁が違いますね。 抗体はウェスタンブロットで使う二次抗体以外滅多に買わないですからね･･･ 試しに、以前買ったHisタグ抗体なんかの取扱説明書を見たりして、どれ位の値なのか見てみようと思いました。 勉強になりました。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2128-6 - 2008/10/17 (金) 14:32:31 - AP オクタロニーは抗体の特異性とか、交差性を見るのにはいいと思いますが、力価の評価にはELISAのほうがいいのではないでしょうか。定量的な測定値がでますし検量線も描けます。市販品、外注品も力価の評価成績はELISAでつけることがほとんどだと思います。 良い抗体、力価の高い抗体というのは結合定数の高いものであって、濃度が低くなっても、結合量が高く保たれるものだと言えるとでしょう。ELISAで検量線を引くと、ある程度の希釈率までは反応が飽和状態で値はほとんど横ばいです。希釈がある程度以上になると濃度依存的に値が急激に下がっています。私は、この値がほぼ一定に保たれる希釈率の限界を力価の目安にしています。それが正式な評価法かどうかは知りません。ひょっとすると、バックグラウンドと区別がつかなくなる希釈率、あるいは50%まで下がる点なんかを見るものなのかもしれません。 とにかく、だいたい市販品でも力価をELISA 1:5000とか1:10000とかで表記されています。ジャクソンだったかどこかのガイドには、おおよその目安として、Westernでは10倍程度、免疫組織染色では100倍程度、表記のELISA希釈率より濃くして使えというようなことが書いてあったと記憶します。

(無題) 削除/引用 No.2128-5 - 2008/10/17 (金) 14:04:27 - antibo EcoRIさん ご丁寧にありがとうございます。 流れとして、ウェスタンブロットも行なおうと考えていました。 過去の研究室では、 なぜか２００倍希釈で行なっているのですが、 濃すぎるし、せっかく獲得した抗血清を多量に使いすぎると思い、 １０００倍希釈くらいを基準に希釈倍率を振った系で行おうと考えていました。 > 希釈度が２０００倍以上でもポジティブな結果を与えるのならば、 > 感度が高いと判断していいと思います。 ２０００倍希釈ですか。 参考にします。 > ５００倍以下でしか使えない、というのであれば、力価は低いと言わざるを得ないでしょう。 これを目安に、結果を見ていくことにします。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2128-4 - 2008/10/17 (金) 13:33:20 - EcoRI 済みにされていますが、私が見落としていましたので、コメントさせてください。 >あと、力価が低い or 高いという判断は、どのように決めているのでしょうか？ オクタロニーは感度が低いので、判断を下せないところがあります。 dot blotやwestern blotなどで、十分量のタンパク質(CBB染色で角丸の細い長方形の美しいバンドを与えるぐらい？0.5 ugぐらいでしょうか)に対して、 希釈度が２０００倍以上でもポジティブな結果を与えるのならば、 感度が高いと判断していいと思います。 市販の二次抗体で２０００倍希釈で使用してください、というのをよく見ますので。 私は２０００倍を目安にしています。 ５００倍以下でしか使えない、というのであれば、力価は低いと言わざるを得ないでしょう。

(無題) 削除/引用 No.2128-3 - 2008/10/17 (金) 00:40:13 - antibo EcoRIさん アドバイス、ありがとうございました。 助かりました。

(無題) 削除/引用 No.2128-2 - 2008/10/16 (木) 17:16:44 - EcoRI 概ねあっていると思います。 ただし、濃度で表すよりは、タンパク質の量で表した方がいいと思います。 (濃度による表現は、結果をあやふやにしてしまう気がします。) 「5 ugの抗原に対して、８倍希釈まで沈降線を確認した」 と言った感じでしょうか？

抗体の力価とは？ 削除/引用 No.2128-1 - 2008/10/16 (木) 13:43:25 - antibo 基礎的なことですが、うまく解釈できていないので教えてほしいことがあります。 それは、「抗体の力価」です。 力価は、どのように表わすのでしょうか？ 獲得した抗血清を用いて、オクタロニー法を行なったところ、 50μg/mlの抗原を用いたとき、抗血清を４倍希釈、 そして、25μg/mlの抗原を用いたとき、抗血清を８倍希釈の条件で、 抗原と抗血清のウェルの丁度真ん中付近に沈降線が形成されました。 こういう結果を得たとき、 力価の表示として、「25μg/mlの抗原のとき、1／8」と表わすので正しいのでしょうか？ あと、力価が低い or 高いという判断は、どのように決めているのでしょうか？ 教えてください。お願いします。

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