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(無題) 削除/引用 No.2125-5 - 2008/10/17 (金) 11:05:35 - おお 皆様ありがとうございます 実際にklenow/T4polと厳密に比べる人はほとんどいないと思いますので、どうこういうのは難しいかもしれませんね。でも、大抵ワークしているようですね。 APさま 私もklenow/T4polを使い分けていましたので、特に後者は普段厳密にタイムコースを取る以外はタイマーを使わない私も、このこうその時はタイマー使います。 Pumpkinさま 細い条件ありがとうございます。それぐらいの条件がいいかなと私も思っていましたので、参考になります。 mugimakiさま 今的には、標準のプロトコールといってもいいところまで来てるような、、、時代の流れをかんじます。

(無題) 削除/引用 No.2125-4 - 2008/10/16 (木) 12:31:54 - AP 私は、昔ながらのKlewow (Fill-up）かT4 DNA polymerase (Plish-up & Fill-up)を使いますが、TOYOBOのBlunting kit (Blunting High)やStratageneのkit (blunting単独用のはないみたいですが、ds cDNAg合成キットの仕上げなど）でKODやPfuをフィーチャーしていますね。 T4 polはfill-inもpolish-upもできるますが、この酵素単独では伸長反応に比してexo活性が高めなため反応条件が微妙で（低温、短時間でコントロールする）、しばしば過剰な3'末端の削りこみが起こって失敗しやすいです。なので、Fill-inだけの時は、3'exoの活性が低く（全くないわけではないらしいですが）削り込みが起こりにくいKlenowを使うというように使い分けしています。 主にDNA合成・増幅に使われるKODやPfuならexo活性に比べて伸長能が高いでしょうから、T4 polより扱いやすいだろうということは想像できます。 ただし、3' exo活性のあるpolymeraseはなんであれそうですが、bluntになって反応が止まるわけではなく、末端の削り込みと伸長を繰り返す平衡状態（交換反応）になります。反応時間が過剰になるとdNTPが枯渇してきて伸長反応が劣勢になり、3' 陥没端ができて失敗する可能性があります（KODもPfuも30分以上やるなとなっていますね）。

(無題) 削除/引用 No.2125-3 - 2008/10/16 (木) 11:18:05 - mugimaki 恥ずかしながらエキソヌクレアーゼの存在を知らず，PCR酵素で行っていた時期がありました． KOD，Pfu(STRATAGENEとBIONEER)で試したことがありますが，どれも問題なく 出来ていました．（本当は効率とかはよくないのかな．．．） 5'突出，3'突出末端をそれぞれの両端にもつFragementで平滑にした場合， 片方は埋まり，片方は削られて平滑になりクローニングしたこともあったので こういうものだと思っていました． Pumpkin様が書いておられるように， PCRのBuffer, dNTPを加え，72℃10minで行っていました． 通常のやり方と比較して，この方法を同時に進めたことはないので， 効率など詳しいことは分かりません． 参考になれば

(無題) 削除/引用 No.2125-2 - 2008/10/16 (木) 11:07:30 - Pumpkin KODでやったことがあります。制限酵素切断したDNA断片の末端をポリッシュするために、KODとバッファ, dNTP, DNA断片とを入れて70℃か72℃で10分位反応させました（今、手元に実験ノートがないので、正確ではありませんが。普通に平滑末端クローニングできましたよ。 確か、イラストレイテッドのような最近のお手軽実験書にも書かれているのを見たことがあるように記憶しています。

耐熱性ポリメラーぜによる、制限酵素断片DNAの平滑化 削除/引用 No.2125-1 - 2008/10/16 (木) 01:30:33 - おお 耐熱性ポリメラーぜはその性質から考えて、DNA末端の平滑化ができるなぁと随分昔にそういうアイデアがよぎったのですが、そうこうしているうちに東洋紡さんが、KODで平滑しょりだできると堂々とカタログや資料に載せるようになってきました。 で質問ですが、KODやその他の耐熱性ポリメラーぜでDNA平滑化をされた方の感想を聞きたいと思います。 酵素の種類とか、感触などご経験を聞かせてください。

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