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(無題) 削除/引用 No.2121-7 - 2008/10/15 (水) 23:56:20 - ひちみ これって簡単ではないような印象を受けます。 膜タンパク同士だと相互作用に貫通領域内にあるアミノ酸のチャージが重要っていう例もあったように思います。 生物種によって脂質の組成が違うので、たんぱく質の膜貫通領域の長さもかわったりしますしね。 あんまり考えすぎないで普通にトランケートをたくさん作るのがいいかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.2121-6 - 2008/10/15 (水) 19:26:13 - とーこ 皆様ご回答ありがとうございます。 >[Re:5] おおさんは書きました :> > ちょっと方法論をかえて、ループの部分だけ細胞質で発現させて、結合を見てはどうでしょうか。 確かにそれなら単純でいいですね。 simple is bestです。 >[Re:2] APさんは書きました : > 膜貫通領域は疎水性なので、ホモジネートにすると、非特異的な疎水結合でfalseがとれてくるという可能性もあると思います。膜貫通ドメイン間の膜外ドメインによる結合とばかりは言えないのではないでしょうか。いっそのこと膜外（細胞質側）だけのtruncated formをbateにしてアッセイたらいいかもしれません。 確かにその心配もあります。 Ｎ末端側の膜外の領域だけのトランケートでは結合しませんでした。 ５膜貫通領域かもしくはそのループ内と考えておりますが、もし膜貫通領域に非特異的であるとすれば、何かで確認することはできないでしょうか？ 少なくとも、そのタンパク質がなんでもかんでも結合しているというわけではないことは免疫沈降で確認しております。

(無題) 削除/引用 No.2121-5 - 2008/10/15 (水) 14:32:50 - おお トポロジーを考えないといけないという指摘がすでにされていますが、私もそのへんがきになります。膜貫通するヘリックスはその両端のサイトゾルあるいは細胞外か小胞ないに出ているアミノ酸の電荷に依存して、向きが決まります(サイトゾル側のアミノ酸に塩基性のものが多くないですか、特にヘリックスのC末の根元に近い部分とか)。ですからその部分を削ってしまうと正常な方向にへリックスが挿入させない可能性がでてきます。 ちょっと方法論をかえて、ループの部分だけ細胞質で発現させて、結合を見てはどうでしょうか。そのあと、細胞質に発現しているその膜タンパクのパートナーに変異またはデリーションなどで結合領域をみつけ、そういう変異体が膜に移行しないとか、その膜タンパクとIPしてワイルドタイプより結合が弱いという風にした方がいいかもしれないと思いました。 もし削りたいのであれば、削るよりもあまり関係ない膜たんぱく質の、サイトゾルのループに置換するのがベターかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2121-4 - 2008/10/15 (水) 14:11:43 - 通りすがり なかなか難しい実験です。少なくとも膜貫通領域を削るのはtopologyに影響を与える可能性が大きいので、それよりも貫通領域をAlaに置きかえた方が良いです。topologyが変わってないことを確認しつつの実験が必要ですね。糖鎖や末端にタグをつけることで確認できます。

(無題) 削除/引用 No.2121-3 - 2008/10/15 (水) 14:10:07 - ats （Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)nのフレキシブルなlinkerに置き換えてはいかがでしょうか。 15merのうち真ん中５merのみでも、相互作用はなくなると思います。

(無題) 削除/引用 No.2121-2 - 2008/10/15 (水) 13:43:29 - AP 膜貫通領域は疎水性なので、ホモジネートにすると、非特異的な疎水結合でfalseがとれてくるという可能性もあると思います。膜貫通ドメイン間の膜外ドメインによる結合とばかりは言えないのではないでしょうか。いっそのこと膜外（細胞質側）だけのtruncated formをbateにしてアッセイたらいいかもしれません。

膜貫通領域間のループの長さ 削除/引用 No.2121-1 - 2008/10/15 (水) 13:08:30 - とーこ 皆さんのアドバイスをいただけたらと思います。 現在小胞体に局在するタンパク質の機能を解析しています。 そのタンパク質は５回膜貫通ドメインを持っています。 そのタンパク質と相互作用する分子（細胞質タンパク質）との領域を決めるためにトランケートフォームによる免疫沈降実験を行っています。 現在わかったことはその５回膜貫通ドメインに相互作用する領域があるということです。 膜貫通領域内部に相互作用する領域があるとわ思えないので、 膜貫通領域間のループを削ろうと思っています。 例えばそのループが１５aaぐらいあったとして、どのくらいまで削っても両端の膜貫通領域に影響与えないで済むでしょうか？ 2,3aaぐらいまで削っても大丈夫でしょうか？ どなたか経験則でも良いので教えていただけると助かります。

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