全9件 ( 1 〜 9 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.2117-12 - 2008/10/15 (水) 18:34:24 - けめ子 atsさん・中年さん 貴重な情報を頂き、ありがとうございました。ろ紙を用いてコロニー単離が可能らしいとは知っていましたが、具体的な方法を知らず、試してみたことがありませんでした。次回、ぜひ試してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.2117-11 - 2008/10/15 (水) 17:26:57 - 中年 私はatsさんの方法でやっています。

濾紙を使う方法 削除/引用 No.2117-10 - 2008/10/15 (水) 17:20:07 - ats 接着細胞のクローニングには、濾紙を使う方法もあります。何かのManual本で知りました。 ピンセットは火炎滅菌し、濾紙（ノートの穴開け器？で直径6mmほどにくり抜く）はオートクレーブしておきます。sigma社に市販品もありました(cloning diskだったかな？）。 コロニーの場所をシャーレ底面にマーキングします。 培地を吸い取り、PBS等で洗浄し吸い取ります。細胞が乾かないうちにトリプシン（+EDTA)をしみこませた濾紙をコロニーに被せて､保温します。載せる前に濾紙の余分なトリプシン液をシャーレ・チューブ等の壁面でぬぐっておくのがコツです。 適当なところで濾紙を剥がし、新しい培地（48-24well dishが良い）に細胞がくっついた濾紙を浸して、培養します。濾紙は次回の植え継ぎまで入れておいてもOKです。 クローニングシリンダーより回収細胞数が少ない(保温時間が短いとシャーレに細胞が残る）ときがある以外、お手軽で、安価です。

(無題) 削除/引用 No.2117-9 - 2008/10/15 (水) 17:02:08 - けめ子 確かに、293やHeLaを物理的に剥がして培養すると接着が著しく悪くなったことがあります。細胞種ごとの「物理的剥離によるダメージの度合い」はコロニーの形状にも原因があるような気がするのですが、どうでしょうか？　ESはかなり「だんご」的なコロニーで接地面が比較的少ないと思います。私が293でステイブルをクローニングするときには、「コロニー」とは言っても比較的横に広がったdisperseな感じで「ほとんど全ての細胞がガッチリ接地している」感じがします。これをチップの先端で物理的に剥がそうとすると、多くの細胞が（接地面に）大きなダメージを受けているような気がします。だんご状のコロニーを形成する細胞ではトリプシンなしで物理的に剥がす方法でのクローニングを適用しやすいのでしょうか？　ES以外でその傾向が強い細胞には、どのようなものがあるでしょうか？ 横レスから質問を発展させてしまって申し訳ありません。細胞コロニーの単離では、常々「もっと楽できる方法はないものかなー」と思っているものですから、この際によろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.2117-6 - 2008/10/15 (水) 15:05:30 - ~ シングルクローンではなく継代時でですが、 接着系のHeLaでトリプシンを使わずに、無理やりピペッティングで剥がして継代したら、 貼りつく細胞の割合がだいぶ低かったときがあります。 無理やり剥がす際のダメージがある細胞とない細胞で、 そのまま剥がすか、ペニシリンキャップでトリプシン処理をするのかが分かれるのだと思います。

横レス質問ですが 削除/引用 No.2117-5 - 2008/10/15 (水) 14:55:35 - けめ子 ESのリコンビナントを単離するときには単純にコロニーをピペットチップの先端で剥がして吸うだけの人が多いのに、一般的な培養細胞ではわざわざクローニングシリンダー（クローニングリング・ペニシリンカップ）を使ってトリプシナイズ後に単離している人が多いように思います。プロトコール本でも、一般の培養細胞のクローニング法としては「クローニングシリンダー」「限界希釈」「メチルセルロース」などが主流で、「ただ剥がして吸うだけ」というのはほとんど載っていません。何か理由があるのでしょうか？　あるいは実際にはクローニングシリンダーを用いている方はあまりおられないのでしょうか？　それとも目的によりけりでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2117-3 - 2008/10/15 (水) 12:36:07 - jacoten へいるさん、ありがとうございました。 普通にやっているということは、何も問題が無いということですよね。 さっそく試してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2117-2 - 2008/10/14 (火) 23:09:32 - へいる stable lineをとるときにはHEK293で普通にやっていますが。

HEK293の継代 削除/引用 No.2117-1 - 2008/10/14 (火) 20:47:48 - jacoten ES細胞のコロニーをクローニングする場合に、細胞のコロニーをチップで吸って96 well-dishに継代したりしますが、HEK293の場合にも同じ事が出来るのでしょうか？ HEK293でのプロトコールを見た事がないのですが、HEK293では出来ない理由があるのでしょうか？ ご教授いただけると幸いです。

全9件 ( 1 〜 9 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---