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もう解決してますよね？ 削除/引用 No.2116-18 - 2009/02/04 (水) 15:10:01 - ｋ SSとFSでゲートはかけていないんでしょうか? かけていれば少々バラバラになってなくとも特に問題は無いと思いますが? 調整用のネガティブに無染使ってないですか? Image068を見た感じ4つに分かれてる様に見えるので（やや右上が上がってるようには見えますが）それぞれが分かれるようにリージョンを引きその割合を見れば良い様に思えるんですが? 間違ってたら済みません。

(無題) 削除/引用 No.2116-17 - 2008/10/17 (金) 00:37:40 - 小児科医師（ゆとり教育） みなさま、ご回答ありがとうございます。設定を中心に洗いなおしてもう一度実験したいと思います。結果はまた報告させていただきます。

(無題) 削除/引用 No.2116-16 - 2008/10/16 (木) 12:17:27 - まっくろん 　私も皆さんがおっしゃるように、FL-1が少し前に出てるように感じます。僕が設定する際に用いている方法を記します。ちょっと長文になりますが、もし参考になれば。 ・用意するサンプル �@アポトーシスを起こした無染色サンプル �A　　　　　 〃　　　　　Annexin染色サンプル �B 　　　　 〃　　　　　 PI染色サンプル �C　　　　 〃　　　　　 Annexin/PI染色サンプル �D アポトーシスを起こしていない無染色サンプル �E 　　 〃　　　　　 Annexin/PI染色サンプル ・手順 1. FSC/SSCスキャッター，FL-1ヒストグラム, FL-2ヒストグラム, FL1/2プロットを表示します。 2. �@および�Dを流し、両ヒストグラムおよびFL1/2プロットでネガティブ領域（FL-1/2プロットでは左下）に検出されるように設定します（このときFSC/SSCスキャッターでは�@サンプルのみFSCの位置が下がります）。 3. �Aを流しアポトーシスが起こっているとFL-1ヒストグラム陽性領域に検出されます（もし２つピークが見られる場合は両ピークの間をポジ/ネガのラインにしてよいと思います）。 4. FL1/2プロットを調節します。このサンプルが、Y軸FL−2陽性に検出されている場合は、compensationでFL-1単独陽性領域（プロット右下）に来るように調整します。逆に、FL-1陽性領域にドットが見られない場合は、下方向に潜り込んでいます。同じくcompensationでFL-1単独陽性領域に来るように調整します。 5.�Bのサンプルを流し,FL-1と同様の手順でFL-2を設定します。 6. ここまで設定できたら�@，�A，�B，�Dのサンプルを同一チューブに混ぜ、流します。うまく設定できていれば、ダブルポジティブ領域（右上）以外の領域にドットが表示されます。 7. 最後に�Cおよび�Eのサンプルを流します。正常細胞ではダブルネガティブ（左下）の割合が高くでます。アポトーシス細胞では、FL-1単独陽性，あるいはFL1/2ダブルポジティブの割合が多くなっています。 　私はこのような手順で行っています。自己流ですので、いくつか問題点もあるかと思います。これを機会に私もご意見をいただければと思います。宜しくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.2116-15 - 2008/10/15 (水) 18:42:23 - TＸ �@ 24時間、Serum freeの状態させた細胞は、以下のようにほとんどの細胞が右下の分画にありました。 http://www.picamatic.com/view/1179752_Image068/ Hoechst 33258による染色で確認したところ、24時間Serum freeにしてもほとんどの細胞は生きているということが分かっています。その状態でアポトー シスを起こす割合は、せいぜい数％です。 �A Single positive(FITC): http://www.picamatic.com/view/1180704_Image071/ �@と�Aを見る限り、皆さんが仰るように FL1のvoltageが明らかに高いですね。 FL1positiveに２つピークがありますが、左のピークがネガティブに 来るようにvoltageを下げる必要があります。 単染を用いてhistogramをみながら調整してみてください。

(無題) 削除/引用 No.2116-14 - 2008/10/15 (水) 16:00:18 - ＩＲＥＳ データを拝見しましたが、予想される傾向はあるように思いますが、AnnexinV-FITCのシグナルが強いように感じます。 AnnexinV+PI染色を行うとき、細胞数はカウントされていますか？ 細胞数に対する過剰のAnnexinVが用いられているように感じました。 説明書には確かAnnexinVに対する適正な細胞数が明示されていたかと思います。もう一つの可能性は488のレーザー出力が高い可能性も考えられますね。 細胞がアグッているかどうかはSSC/FSCのドットプロットで確認できませんか？

？？？ 削除/引用 No.2116-13 - 2008/10/15 (水) 12:57:59 - DDD >10% Fetal Bovine Serum mediaで培養してすぐにtrypsin+EDTAにて浮遊・回収しフローサイトメトリーを行った細胞は、Serum Free 24hrとほとんど同様の結果でした。http://www.picamatic.com/view/1179752_Image068/ ってこれおかしくないですか？ この細胞集団がAnnexin+にでていることが不思議です。 >Double negativeのコントロールに用いている細胞(これらは細胞死を 起こす刺激は与えず、Annexin PIでは染色されていますよね？) 上記は私のコメントですが、もしかしてDouble negativeは染色を 行っていないのでしょうか？ 刺激なしでhttp://www.picamatic.com/view/1179752_Image068/になる ようでしたら、設定がおかしいと思います。 刺激なしの細胞がnegativeに来て、アポトーシスを起こす薬剤で 処理したものがpositiveに分かれるようにコントロールをとって設定 しないとダメだと思います。

(無題) 削除/引用 No.2116-12 - 2008/10/15 (水) 07:07:04 - 小児科医師（ゆとり教育） >　見当違いだったらすいません。 いえいえ、ご回答いただけてとても助かっております。 >アポトーシス誘導していない細胞をAnnexin-PI染色するとどうなりますか？ 10% Fetal Bovine Serum mediaで培養してすぐにtrypsin+EDTAにて浮遊・回収しフローサイトメトリーを行った細胞は、Serum Free 24hrとほとんど同様の結果でした。http://www.picamatic.com/view/1179752_Image068/ （本来であれば、元データをお示しするべきなのですが、データは研究室のパソコンに入っており、今は自宅から接続しているため、代替のデータを提示させていただきます。申し訳りません。） >その細胞でもAnnexin+になるようであれば、染色に問題があると感じます。 私も同様に考えて、染色だけの問題であればなんとか解決できないかと考えています。 >　もう一つ、Annexin染色の際は、on iceですか？以前使っていたものは室>温であったような？？キットによって違うんですかね？ 私の持っているデータシートには、「Keep tubes on ice and incubate for 10 min」と書かれていました。

(無題) 削除/引用 No.2116-11 - 2008/10/15 (水) 06:47:58 - 小児科医師（ゆとり教育） ご回答、誠に感謝しております。 >それに細胞がばらばらになっていないといいますが、メッシュは通して >ないのでしょうか？ メッシュは今までは通していませんでした。次回より使用を検討していたところです。細胞がばらばらになりにくい場合、メッシュを1回だけではなく2回通すとより均一な細胞群になるということはあるでしょうか？ >気になるのは、Annexin+の細胞集団はアポトーシス初期のものを検出 >しているので、PIでは染まらないわけです。Hoechst 33258は生細胞では >染色されず、固定すると染色できる点から考えて、 >Hoechst 33258で染色した時間ではまだ膜に穴は空いていないが、 >アポトーシス初期の段階であるため、Annexin+になっているのではないでし>ょうか？ 確かにその可能性は考えられると思いますが、Serum　Free24時間のみでアポトーシスを起こすという文献はなく、いままでに検索したすべての論文でSerum　Free24時間のみではアポトーシスは誘導されないという結果でした。ただし、今までに検索できたなかで今回使用している細胞に対しフローサイトメトリーを行った論文は見つかりませんでした。

まだ理解しきれてませんが 削除/引用 No.2116-10 - 2008/10/14 (火) 19:42:16 - DDD >24時間、Serum freeの状態させた細胞は、以下のようにほとんどの細胞が右下の分画にありました。http://www.picamatic.com/view/1179752_Image068/Hoechst 33258による染色で確認したところ、24時間Serum freeにしてもほとんどの細胞は生きているということが分かっています。その状態でアポトーシスを起こす割合は、せいぜい数％です。 眼下観察でアポトーシスの割合が少ないにも関わらずフローサイトメトリー を用いたAnnexin　PIの観察からアポトーシス分画に多くが検出されることから >細胞がうまくひとつひとつばらばらになっていないため、Annexin検出の設定がうまくいっていない、またはAnnexinの蛍光が強く出すぎるという結果になっているのではないかと考えています。 という考えをお持ちということでしょうか？ 拝見した図からはきちんとコントロールがとれていると思います。 本来Annexin negativeだと考えている細胞が設定によりpositive分画に 現れるならdouble negativeに用いた細胞集団もpositive分画に検出 されると思いますが？ それに細胞がばらばらになっていないといいますが、メッシュは通して ないのでしょうか？ 設定はきちんとできているけど、Serum freeの状態の細胞がバラバラに なっていないため蛍光強度が強くpositiveに検出されているとお考えなら Double negativeのコントロールに用いている細胞(これらは細胞死を 起こす刺激は与えず、Annexin PIでは染色されていますよね？) もバラバラにならずに同様に検出されると思います。 気になるのは、Annexin+の細胞集団はアポトーシス初期のものを検出 しているので、PIでは染まらないわけです。Hoechst 33258は生細胞では 染色されず、固定すると染色できる点から考えて、 Hoechst 33258で染色した時間ではまだ膜に穴は空いていないが、 アポトーシス初期の段階であるため、Annexin+になっているのではないでしょうか？ Serum free 24時間でアポトーシスが起こっていないと考える根拠が もうひとつわからないのですが、何かありますでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2116-9 - 2008/10/14 (火) 19:13:05 - まっくろん 　見当違いだったらすいません。アポトーシス誘導していない細胞をAnnexin-PI染色するとどうなりますか？その細胞でもAnnexin+になるようであれば、染色に問題があると感じます。一方で、非アポトーシス細胞でAnnexin-であれば、それはそのような結果であるかと。 　もう一つ、Annexin染色の際は、on iceですか？以前使っていたものは室温であったような？？キットによって違うんですかね？

(無題) 削除/引用 No.2116-8 - 2008/10/14 (火) 18:19:43 - 小児科医師（ゆとり教育） 以下のようになっております（分割しないと登校できなかったのでこのようにさせていただきました。見難くて申し訳ありません）。このような場合、検出の設定が悪いのか、Annexinの蛍光が強いのかどちらの可能性が考えられるでしょうか？ご教授いただけると幸いです。

(無題) 削除/引用 No.2116-7 - 2008/10/14 (火) 18:18:31 - 小児科医師（ゆとり教育） Single positive(PI): http://www.picamatic.com/view/1180707_Image072/ Double positive(FITC+PI): http://www.picamatic.com/view/1179766_Image069/

(無題) 削除/引用 No.2116-6 - 2008/10/14 (火) 18:17:08 - 小児科医師（ゆとり教育） Double negative: http://www.picamatic.com/view/1179983_Image070/ Single positive(FITC): http://www.picamatic.com/view/1180704_Image071/

(無題) 削除/引用 No.2116-5 - 2008/10/14 (火) 18:14:55 - 小児科医師（ゆとり教育） test

(無題) 削除/引用 No.2116-4 - 2008/10/14 (火) 15:30:30 - DDD Annexin-FITCとPIによる二重染色であるならば Double negative Single positive(FITC) Single positive(PI) Double positive(FITC+PI) があると思うのですが、どうなっているのでしょうか？ これらがきちんととれていれば >以上のことから、細胞がうまくひとつひとつばらばらになっていないためAnnexin検出の設定がうまくいっていない、またはAnnexinの蛍光が強く出すぎるという結果になっているのではないかと考えています。 検出の設定が悪いのか、Annexinの蛍光が強いのか判別つくと思いますが。。。

(無題) 削除/引用 No.2116-3 - 2008/10/14 (火) 14:18:47 - 小児科医師（ゆとり教育） 御回答、ありがとうございます。 10mMの過酸化水素に2時間反応させた細胞をpositive control、24時間Serum freeの細胞をnegative controlとして使用する予定です。Annexin (-)、PI (-)の10mMの過酸化水素に2時間反応させた細胞の結果は以下の通りでした。 http://www.picamatic.com/view/1179983_Image070/

(無題) 削除/引用 No.2116-2 - 2008/10/14 (火) 13:24:19 - DDD >以上のことから、細胞がうまくひとつひとつばらばらになっていないためAnnexin検出の設定がうまくいっていない、またはAnnexinの蛍光が強く出すぎるという結果になっているのではないかと考えています。 とのことですが、Negative controlはどういう状態なのですか？

接着細胞のフローサイトメトリー 削除/引用 No.2116-1 - 2008/10/14 (火) 12:57:45 - 小児科医師（ゆとり教育） 現在、腎尿細管細胞（接着細胞）のアポトーシスをフローサイトメトリーにて定量しようと試みています。使用している試薬は、RocheのAnnexin-V- FLUOUS staining kit(Annexin-FITCとPI)です。手順は、以下の通りにやっています。 1.トリプシン/EDTA 処理で浮遊させる。→遠心 2. 細胞を2 % FCS / 0.1 % NaN3 / PBS で懸濁する。→遠心 3. 100 ulのBufferに懸濁する 4. Annexin-FITCとPIを加え、15分氷上にて反応させる 5. 400ulのBufferを加え、すぐにFACSにて測定 結果は、10mMの過酸化水素に2時間反応させた細胞は、以下のようにほとんどの細胞が右上または右下の分画にありました。 http://www.picamatic.com/view/1179766_Image069/ 他の論文によると、10mMの過酸化水素に2時間反応させるとかなりの割合の細胞がネクローシスを起こす（右上の分画）ということが分かっています。 24時間、Serum freeの状態させた細胞は、以下のようにほとんどの細胞が右下の分画にありました。 http://www.picamatic.com/view/1179752_Image068/ Hoechst 33258による染色で確認したところ、24時間Serum freeにしてもほとんどの細胞は生きているということが分かっています。その状態でアポトー シスを起こす割合は、せいぜい数％です。 以上のことから、細胞がうまくひとつひとつばらばらになっていないため、Annexin検出の設定がうまくいっていない、またはAnnexinの蛍光が強く出す ぎるという結果になっているのではないかと考えています。 そこでお聞きしたいのですが、フローサイトメトリーで使用する接着細胞をばらばらにするときにどのような方法でやるのが良いでしょうか？ご教授 いただけると幸いです。

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