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(無題) 削除/引用 No.2115-11 - 2008/10/15 (水) 23:10:31 - qq 免疫沈降をproteinGを使わないで、もっと古典的な抗血清＋抗原試料でやってみるとか、別のスレッドに出ていたオクタロニーで沈降線を作るといった方法を使う方がよいかもしれませんね。 学会出版センターからでている免疫実験法（？）の実験書などをみてみてはいかがでしょうか。 「ヘマトクリット管に試料と抗血清を重層して、ゆっくりと免疫沈降を待つ」ような方法があったと思います。

ヒト血清IgGでの免疫沈降 削除/引用 No.2115-10 - 2008/10/15 (水) 22:43:30 - yasu ~さん はい。両サンプルに共通する非特異的なバンドもあります。すでに１か月ほどこのIPで実験がストップしており、自分なりにいろいろな可能性を試してみたつもりですが上手くいかないので、2D-PAGEを頼める共同研究先を探してみます。 ＤＮＡＩさん もちろん二次抗体だけや両サンプルに共通する非特異的なバンドもありますので、患者群だけに見られるバンドを解析する予定でいます。

(無題) 削除/引用 No.2115-9 - 2008/10/15 (水) 17:49:37 - ＤＮＡＩ >、患者由来のものと健常コントロール由来の2種類の血清IｇGを使用することになりますので >上記IgGとcell lysateでのWestern blottingでは、100kDa、35kDa付近にバンドがでており 二次抗体による非特異陽性の可能性はないですか？ 健常者の精製IgGによるＷＢにて上記のバンドが検出されていないのならば問題ないと思いますが。 以前抗体評価の際、予想されるサイズのバンドを検出して喜んでいたのですが、二次抗体による非特異のケースと、免疫前血清でもクロスしていたケースがありました…。

(無題) 削除/引用 No.2115-8 - 2008/10/15 (水) 09:43:27 - ~ >、患者由来のものと健常コントロール由来の2種類の血清IｇGを使用することになりますので >上記IgGとcell lysateでのWestern blottingでは、100kDa、35kDa付近にバンドがでており 患者由来のIgGでWBのバンドが出ているのですよね？ 非特異のバンドも多いのでしたら、患者由来と健常人由来のIgGでそれぞれ2D-PAGE→Immunoblotして、患者由来IgGで特に強く出るスポットを同定されてはいかがでしょうか？ 2D-PAGEを頼める共同研究先を探すとの、 免沈の条件検討が終わるのとどちらが早いのかは分かりませんが、 系が立ち上がっているラボであれば、サンプルを送れば1週間経たずに泳動までは終わると思います。

ヒト血清IgGでの免疫沈降 削除/引用 No.2115-7 - 2008/10/15 (水) 08:24:50 - yasu う-んさん どのくらいのIgGを使用するかは、サンプルによってもちろんoptimizationが必要でしょうから、正解は特にないと思います。ただ私がびっくりしたのは、Pierce社のSeize Xや、GE HealthcareのProtein G HP SpinTrapのマニュアルでは、50-500ugの抗体を使用するように指示されている点です。

(無題) 削除/引用 No.2115-6 - 2008/10/14 (火) 21:49:08 - う-ん そうでしたか、それは失礼しました。

ヒト血清IgGでの免疫沈降 削除/引用 No.2115-5 - 2008/10/14 (火) 21:01:36 - yasu 皆様アドバイスありがとうございます。 う-んさん モノクロやポリクロの抗体で免沈するときは１-２ugで十分なようですが、血清のように特定の抗原でアフィニティーに精製されていない場合は時には250ugくらいも使用するようです。でも抗体が多すぎることで反応がうまくいかないこともありそうですね。 ~さん ２Dは経験がないのでよくわからないのですが、私の場合、使用するタンパク（cell lysate）は共通で、患者由来のものと健常コントロール由来の2種類の血清IｇGを使用することになりますので、いずれにしても免沈は避けて通れないと思うのですがいかがでしょうか？ atsさん Denaturing Lysis bufferに関してはIgGと反応させる前に、Non-denaturing Lysis bufferで10倍希釈していましたので、反応時、SDSは0.1％になっていますが、TritonXは１％のままなので、次回は希釈bufferでの希釈試してみたいと思います。同様にNon-denaturing Lysis bufferも、反応前に希釈bufferで希釈してみようかと思います。 Westernで検出できてIPで検出できない（エクストラバンドすらほとんど見えない）のでやはりIgGとの反応に問題がありそうです。 とりあえずatsさんの方法を試してみて、またご報告させていただきます。

(無題) 削除/引用 No.2115-4 - 2008/10/14 (火) 13:24:12 - ats 溶液組成が抗原抗体反応を弱くするようなので、 Non-denaturing Lysis buffer に関して、溶解後IgGと混ぜるときに 1% TritonX>0.1%、同様に、300mM NaCl＞150mM、10mM dithiothreitol＞1mMへ下げる。 (希釈bufferで10倍希釈など） Denaturing Lysis buffer：1% SDS＞max 0.1%（可能なら0.1%で溶解＞0.01%へ希釈）, +NaCl 150mM添加、（option:希釈時Triton 0.1%追加、またSDSよりUreaの方がよいかも？） では、どうでしょうか。 （SDSはもちろんですが）Tritonは、抗体・抗原の結合を弱めるときがあります。

(無題) 削除/引用 No.2115-3 - 2008/10/14 (火) 12:46:25 - ~ IgGが比較的豊富にあるようですので、2D-PAGEでスポットを同定して、 LC-MS/MSにかけてみてはいかがでしょうか。 反応するタンパク質の情報は有用だと思います。

(無題) 削除/引用 No.2115-2 - 2008/10/14 (火) 12:07:48 - う-ん >使用試薬など。 Protein G Sepharose beads: 40uL IgG purified from human serum : 100ug Cell lysate : 500ug Denaturing Lysis buffer : 1% SDS, 5mM EDTA in 50mM Tris-HCl pH 7.4 + DTT + Protease inhibitors + DNase1 Non-denaturing Lysis buffer : 1% TritonX 300mM NaCl, 5mM EDTA in 50mM Tris-HCl pH7.4 + 10mM dithiothreitol + Protease inhibitors IgG purified from human serum : 100ug！！？ 100 ugも使うのはいいのでしょうか？

ヒト血清IgGでの免疫沈降 削除/引用 No.2115-1 - 2008/10/14 (火) 11:52:58 - yasu 自己免疫疾患患者血清から精製したIgGとHUVEC cell lysateで免沈→SDS PAGE→銀染→バンド切り出し→LC-MS/MSなどで自己抗原を同定しようとしていますが、免沈がうまくいかず困っています。上記IgGとcell lysateでのWestern blottingでは、100kDa、35kDa付近にバンドがでており、免沈→SDS PAGEでも同じバンドの出現を期待していたのですがIgGのバンドしか出ません。IgGがdenatureしたcell lysateしか認識しない可能性も考え、denaturing lysis bufferでlysateを調整してみましたがダメでした。 ProteinGとIgGをincubateした後Sup中のIgGを測ってみると、ProteinGとIgGの結合はきちんと行われているようですし、各ステップを確認した結果おそらくIgGと蛋白が結合していないものと思われます。cell lysateとIgG-beadsの反応は、４℃２時間、overnight、室温1時間いずれもダメでした。 次に打つ手がなくなり行き詰っておりますので、同じような経験のある方などアドバイスよろしくお願いします。 使用試薬など。 Protein G Sepharose beads: 40uL IgG purified from human serum : 100ug Cell lysate : 500ug Denaturing Lysis buffer : 1% SDS, 5mM EDTA in 50mM Tris-HCl pH 7.4 + DTT + Protease inhibitors + DNase1 Non-denaturing Lysis buffer : 1% TritonX 300mM NaCl, 5mM EDTA in 50mM Tris-HCl pH7.4 + 10mM dithiothreitol + Protease inhibitors

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