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(無題) 削除/引用 No.2114-15 - 2009/10/15 (木) 21:33:04 - NS 5'UTRがない遺伝子はおそらくないと思います。ネット上に5'UTR配列が登録されていないのは、その遺伝子の5’RACEをおこなっていないからだと思います。また、登録されていても予想でしかないものもあります。つまり、実際は5’UTRが特定できていないことになります。ですので、5’RACEをして特定するしかありません。

DB 削除/引用 No.2114-14 - 2008/10/16 (木) 01:57:35 - もとchick研究者 >普段はNCBIのGenbankを使ってます。 最新のESTデータベースというのは、どこに行けばいいのでしょうか？ NCBI以外でどこかいいサイトがあれば教えてください。 ここの右下のリンクを参照。 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/chicken/

(無題) 削除/引用 No.2114-13 - 2008/10/16 (木) 01:19:31 - 苦労人 ボスに相談して、humanとmouseなどの配列とアライメントしたところ、 より下流にもう一つATGが見つかり、そこから開始する可能性が高いようです。 いずれにせよ登録されていた配列は正確ではないようです。 その場所のプライマーを設計してだめだったら、 おおさん、ひちみさん、APさんの方法も参考にしてみます。 お騒がせしました。

(無題) 削除/引用 No.2114-12 - 2008/10/15 (水) 12:14:24 - ひちみ >普段はNCBIのGenbankを使ってます。 ATGから始まってるような登録配列は予測配列であることが多いですし、昔のチキンゲノムの印象からもそう思いました。 遺伝子の配列予測やアノテーションが全て最新のデータベースに依拠しているわけではないです。 ご自分が取得された部分だけをQueryにしてEST等のmRNA由来の配列DBを検索して複数の配列がヒットしたら、それらを多重配列にしてみるとスプライスバリアント等がわかることがあります。 DBのアノテータもこういった作業を経てデータの更新をしていますが、DBの成長に作業が追いつかないようです。 なので、ご自分でこういった作業をされてなければしてみるといいですよ。 というのが先の投稿の主旨です。 いずれにしろクローニングなさるのでしょうが、DB検索でもある程度配列を稼げると思います。

(無題) 削除/引用 No.2114-11 - 2008/10/15 (水) 10:53:53 - AP >[Re:10] 苦労人さんは書きました : > >実験的に転写産物や遺伝子の構造が明らかになっているわけではなく、ゲノム配列から予測プログラムを使って予測されたcomputed geneだからでしょう。 > > 確かに、DEFINITIONがPREDICTED: Gallus gallus similar to XXX,mRNA. > となっています。これはコンピュータで予想された配列という意味でしょうか？ > PREDICTEDといっているからそうですね。 > >oligo-dT primingしたRT-PCRだと、5'端まで逆転写が届いていないかもしれません。そのために開始コドン付近がかけていてPCRがかからないのかも。 > Random primingして5' RACEで5'端をとって、後半部とつなぎ合わせたらいいと思います。 > > 5' RACEというのは経験がないのですが、何か特別な試薬が必要ですか？ > 逆転写の時はoligo-dTではなく、Random primerを使いましたが、それでもまだ不十分なんですか？ Random primerを使っているので、5'末端から3'末端まで一本取りでPCRをかけようとしてもだめということでは？　 ATG付近のプライマーと転写産物中ほどのプライマーでPCRをかけてもだめですか？もしそうだとしたら、予測が間違っていてそのATG付近はエクソンに入っていない可能性が高くなりますね。 5' RACEの方法はいろいろあります。各社からキットが出ているのでカタログなど参照してください(たとえばClontechのMarathon kit）。 一般的によく使われるのは、2nd strandまで合成して二本鎖にしたcDNAの両末端にアダプターをligationして、アダプタープライマーと、5'末端方向に向いたgene specific primerでPCRをかける方法です。gene specific primerを3'末端向きにすると、3' RACEになります。アダプタープライマーを使うので末端の配列が未知でもPCRがかかります。高価なキットを買わなくても、アダプターとプライマーだけ合成したり、既製品を買ったりすれば、あとはあるものでできるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.2114-10 - 2008/10/15 (水) 01:16:06 - 苦労人 >実験的に転写産物や遺伝子の構造が明らかになっているわけではなく、ゲノム配列から予測プログラムを使って予測されたcomputed geneだからでしょう。 確かに、DEFINITIONがPREDICTED: Gallus gallus similar to XXX,mRNA. となっています。これはコンピュータで予想された配列という意味でしょうか？ >oligo-dT primingしたRT-PCRだと、5'端まで逆転写が届いていないかもしれません。そのために開始コドン付近がかけていてPCRがかからないのかも。 Random primingして5' RACEで5'端をとって、後半部とつなぎ合わせたらいいと思います。 5' RACEというのは経験がないのですが、何か特別な試薬が必要ですか？ 逆転写の時はoligo-dTではなく、Random primerを使いましたが、それでもまだ不十分なんですか？ >現状をフォローしていませんが、最新のESTデーターベース等をご自分で検索してみるのも有効かと思います。 普段はNCBIのGenbankを使ってます。 最新のESTデータベースというのは、どこに行けばいいのでしょうか？ NCBI以外でどこかいいサイトがあれば教えてください。

(無題) 削除/引用 No.2114-9 - 2008/10/14 (火) 14:21:11 - ひちみ チキンのゲノムがリリースされてすぐの頃に眺めたことがありますが、遺伝子予測がかなりいい加減だったように記憶しています。 参照したゲノムが哺乳類だったために予測が難しかったせいもあるでしょうが、当時EST等の情報が不足していたように思います。 現状をフォローしていませんが、最新のESTデーターベース等をご自分で検索してみるのも有効かと思います。

(無題) 削除/引用 No.2114-8 - 2008/10/14 (火) 10:33:51 - AP >全長3kbで500b〜3000までは増幅できるのに、 ATGからだとなぜか増幅できません。そういう場合は5' UTRのprimerを試す以外に何か方法ありますか？ そこまでできているなら、5' RACEがいいでしょう。 ライブラリーからクローニングしたcDNAでも、oligo-dT primingのだと5'側がかけていることが多く、補完するためにすることがよくあります。 oligo-dT primingしたRT-PCRだと、5'端まで逆転写が届いていないかもしれません。そのために開始コドン付近がかけていてPCRがかからないのかも。 Random primingして5' RACEで5'端をとって、後半部とつなぎ合わせたらいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2114-7 - 2008/10/14 (火) 09:41:58 - おお >[Re:6] APさんは書きました : > 実験的に転写産物や遺伝子の構造が明らかになっているわけではなく、ゲノム配列から予測プログラムを使って予測されたcomputed geneだからでしょう。ORFの予測を基本として、exon-intron予測をするようで、そういう場合はふつう開始コドンが開始点になっています。 予測されただけのデーターからとっといるとしたら、予測が外れていてPCRがかからない可能性も確かにありますね。得られたシーケンスについている情報をもう一度確認する必要があるかもしれませんね。 あるいはcDNAをとるか、取得するか、、

(無題) 削除/引用 No.2114-6 - 2008/10/14 (火) 08:58:30 - AP 実験的に転写産物や遺伝子の構造が明らかになっているわけではなく、ゲノム配列から予測プログラムを使って予測されたcomputed geneだからでしょう。ORFの予測を基本として、exon-intron予測をするようで、そういう場合はふつう開始コドンが開始点になっています。1st exonがORFを持たなかったりすることがざらなので、転写開始点の予測は困難です。ゲノムプロジェクトが先行しているモデル生物でも状況は同じで、より正確なannotationは、ESTプロジェクトやtranscriptomeプロジェクトなどの成果に依存しています。 ribosomeが結合するための配列が必要ですからATGの上流にUTRがないというのは考えられません。ですから、ゲノム配列上で、ATGからある程度さかのぼった領域はUTRであると予想できます（あまりに遠いと、intronや、転写開始点より上流になってしまうかもしれません）。 PCRがかからないのは、ひょっとするとcomputed geneが実際の構造とは違っているからかもしれません。確実なORF配列から、RACEやlibrary screeningして、自力で構造を決めるところからやったほうがいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2114-5 - 2008/10/14 (火) 07:00:25 - おお きっとその遺伝子ということで検索しているので、たまたまその遺伝子のコーディングの部分だけを登録したデーターを拾ってきたのではと思います。その配列でブラストをかけたりすると、その遺伝子領域を含むBACやファージのクローンの配列とか手に入るかもしれません。 チキンはあまりデーターベースを使わないので、詳しくは分かりませんが。。。

(無題) 削除/引用 No.2114-4 - 2008/10/14 (火) 06:38:40 - 苦労人 その周辺のゲノムの情報を確認してみると、first exonがATGから始まっているようです。 これは何を意味してるんですか？ 5' UTRはmRNAの一部である以上は、エクソンの内部なんですよねえ。 全長3kbで500b〜3000までは増幅できるのに、 ATGからだとなぜか増幅できません。 そういう場合は5' UTRのprimerを試す以外に何か方法ありますか？

(無題) 削除/引用 No.2114-3 - 2008/10/14 (火) 06:25:58 - おお 追加ですが、そのあたりのゲノムの配列が手に入れば、比較的簡単だと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.2114-2 - 2008/10/14 (火) 04:56:22 - おお http://www.ensembl.org/ こことかはどうでしょうか? いまメンテ中でつながりませんが、、

5' UTR配列の入手方法 削除/引用 No.2114-1 - 2008/10/14 (火) 00:49:33 - 苦労人 ATGから始まるprimerがうまく働かないので、5' UTRのprimerを設計しようと考えています。 そこで、チキンのある遺伝のを5' UTR(開始コドンより上流)の配列情報がほしいのですが、 ATGより前の情報が登録されていません。これは5' UTRがないという意味でしょうか？ Genomeを調べてみると、遺伝子自体がATGから始まっていて、その上流は非遺伝子領域になっているようです。5' UTR自体を持たない遺伝子は存在するのでしょうか？

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