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RNA抽出時の組織ホモジナイズ処理について トピック削除
No.210-TOPIC - 2007/09/18 (火) 22:58:41 - Kazacky
RNA抽出時における組織のホモジナイズ処理について質問させて下さい。

現在，マウス胸腺組織からQIAGENの"RNeasy Mini"を利用して
RNA抽出を行おうとしています。
マニュアルでは組織のホモジナイゼーションについて，Bufferを加えた後に

「ローター／ステーター方式ホモジナイザーを用いて
　均一になるまで組織を破砕，ホモジナイズする
　（通常20〜40秒）。」

と指示しています。
おそらくこのホモジナイザーは電動式のポリトロンホモジナイザーを
指していると思うのですが，これを手作業のポッターホモジナイザー
（すりガラスの細長いやつです）で代替することは可能でしょうか。
（うちの研究室にはポリトロンホモジナイザーがないのです）

実験に供する組織はRNAlaterで安定化していますので，
氷冷しながらホモジナイズすることで温度の上昇を抑えれば，
RNAのdegradationを最小限に抑えきちんとした抽出ができるのでは？
と考えているのですが……

やはり電動式でないときちんとした破砕はできないのでしょうか。


別のフォーラムで，「注射針を何回か通せば大丈夫ではないか」との
ご指摘も頂きましたが，「それじゃ無理」「うちではこうやってる」
というような知見がありましたら是非お教えください。
　
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(無題) 削除/引用
No.210-5 - 2007/09/19 (水) 18:41:03 - Kazacky
皆様ありがとうございます！！

>>モノクロさま
1.5mLチューブ用のホモジナイザーなんてあるんですね！！初耳でした。
これならクロスコンタミも無さそうですし，ちょっと探してみます。
胸腺組織はあまり硬くないので，セルストレーナーまではいらないかと思います。

>>ハリーさま
同じ環境で実験されている方からの意見は非常に勇気付けられます。
皆さんからの意見や，自分で調べてみたことを今度色々試してみようかと思っています。

>>searaさま
なるほど。QIAshredderという手もありましたね。確か前の人が使い残したのがあったはず…
ポッターである程度ホモジナイズ→QIAshredderにかける
というのが一番良さそうな気がします。
で，できればホモジナイザーはプラの安いものでクロスコンタミを防ぐ，と。

結合組織が多い組織についてはとりあえず扱う予定はないのですが，
今後もし扱わなければならなくなった場合参考にさせていただきます！

たぶん 削除/引用
No.210-4 - 2007/09/19 (水) 14:06:01 - seara
マウスの胸腺組織と言うことですが胸腺細胞だったら組織を扱けば十分バラバラなのでそのままライシスしてしまって、ホモジナイザーまでしなくてもいいと思います。
結合組織が多いのは（腎臓とか大腸とかでも）私はペストルタイプではくだけたのかどうかいまいちなのに時間がかかるので品質が落ちたような気がしていやだったです。トリッキーですが生状態だと砕きがうまくいかない組織の時は一度凍らせてはさみかナイフで細かくするで（その後が同じ作業だとしても）バラバラ度があがって回収量があがりました。
QIAGENを使っていらっしゃるようでしたらQiaShuledderを通す方法の方が作業時間の短さから言って品質がまだいいような感じで好きです。
あ、スリガラスのってことはディスポじゃないかもしれませんね。多分毎回きれいにするんでしょうがRNAならRT-PCRでもなんでも微量の話が多いと思うのでできればモノクロさんの”1.5mLチューブ用のプラスティックのホモジナイザー”でチューブは使い捨てがコンタミなくていいと思います。

私自身は、間質等の結合組織が多そうなのはあえていうならQIAGENの"RNeasy Mini"だけだととれがわるいです。フェノール系のIsogenでもTrizolでもいいから抽出してからクリーンナッププロトコールでRNeasy Miniがおすすめです。

(無題) 削除/引用
No.210-3 - 2007/09/19 (水) 11:32:56 - ハリー
ポッターホモジナイザーでも大丈夫と思います。
我々の研究室ではガラスのものでやっています。

余力があれば、いろいろ試されると良いと思います。

(無題) 削除/引用
No.210-2 - 2007/09/19 (水) 09:00:21 - モノクロ
培養細胞からRNAを抽出する際は、一応1.5mLチューブ用のプラスティックのホモジナイザーを使ってます。ただし、数回念入りにピペッティングした場合でも、同程度の収量でした。胸腺組織が硬いとすれば、はさみで切れ目を入れセルストレーナー等で細胞に単離させることで、より収率があがるかと思います。

RNA抽出時の組織ホモジナイズ処理について 削除/引用
No.210-1 - 2007/09/18 (火) 22:58:41 - Kazacky
RNA抽出時における組織のホモジナイズ処理について質問させて下さい。

現在，マウス胸腺組織からQIAGENの"RNeasy Mini"を利用して
RNA抽出を行おうとしています。
マニュアルでは組織のホモジナイゼーションについて，Bufferを加えた後に

「ローター／ステーター方式ホモジナイザーを用いて
　均一になるまで組織を破砕，ホモジナイズする
　（通常20〜40秒）。」

と指示しています。
おそらくこのホモジナイザーは電動式のポリトロンホモジナイザーを
指していると思うのですが，これを手作業のポッターホモジナイザー
（すりガラスの細長いやつです）で代替することは可能でしょうか。
（うちの研究室にはポリトロンホモジナイザーがないのです）

実験に供する組織はRNAlaterで安定化していますので，
氷冷しながらホモジナイズすることで温度の上昇を抑えれば，
RNAのdegradationを最小限に抑えきちんとした抽出ができるのでは？
と考えているのですが……

やはり電動式でないときちんとした破砕はできないのでしょうか。


別のフォーラムで，「注射針を何回か通せば大丈夫ではないか」との
ご指摘も頂きましたが，「それじゃ無理」「うちではこうやってる」
というような知見がありましたら是非お教えください。
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