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(無題) 削除/引用 No.2098-9 - 2008/10/11 (土) 05:06:56 - おお そういう場合はあまり考えないでブラントでやることが個人的には多いです。それでもたいてい取れますので。ブラントにして置けばベクターにT、インサートのAをつけてTAというても取れますし、、あとはアダプタ-を使うとかでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2098-8 - 2008/10/11 (土) 02:25:29 - ひちみ partial digestionしたフラグメントを電気泳動して、欲しいサイズのバンドを切り出してライゲーションするって方法もあります。3ヶ所もあると目的のバンドがとりにくいかもしれませんけど、参考まで。

(無題) 削除/引用 No.2098-7 - 2008/10/11 (土) 01:02:03 - AP >度々済みません。Sph1 は３突出ですね。Bbs1は使えないですね。 やるなら、BstXIですかね。BlueScriptのクローニングサイトにもあったはずなので、買い置きがあったりして。 PCRでインサートの末端配列を自由につけられるという前提だと、 Bgl2-BstX1にできればラッキーかも。 Bgl2が使えないとなったら、XhoIやXbaIはどうでしょうか。 partial fillingすると（加えるヌクレオチド種を制限して、fill-in反応。2塩基や1塩基の突出を作る）、同じくpartial fillingしたBamHI末端とコンパチブルにすることができます。

(無題) 削除/引用 No.2098-6 - 2008/10/11 (土) 00:14:20 - あべちゃん 度々済みません。Sph1 は３突出ですね。Bbs1は使えないですね。 Bbs1以外の情報NEB にあります。 http://www.neb.com/nebecomm/tech_reference/restriction_enzymes/multiple_recognition_sequences.asp 3突出で４塩基のもの、無いですね。 つまり、Sph1は少なくともブラントかな。 どうしてもブラントは駄目だとなると、僕はベクター側に好きなサイトを入れますね。 ∆BamH1 + (お好み制限酵素サイト１) + (スペーサー配列) + (お好み制限酵素サイト２） + (∆Sph1)となるように、オリゴを設計し、ハイブリさせた断片をベクターにいれる。 そのベクターに目的遺伝子を挿入する。という具合です。 ２ステップになるので、どうしてもサイトがない、ブラントで入らない場合、限定の方法ですが。

(無題) 削除/引用 No.2098-5 - 2008/10/10 (金) 23:59:26 - あべちゃん APさんの仰るように、突出部分のみ相補する制限酵素を利用するのが１つです。 NEB のホームページにある http://www.neb.com/nebecomm/tech_reference/restriction_enzymes/cross_index_recognition_sequences.asp なんか、べんりですよ。 あと、Bbs1など、切断部分と認識部位とが異なる制限酵素があります。 これだと、切断部分の配列は任意なので、Sph1のコヒーシブ部分が丁度切断されるように設計することができます。

(無題) 削除/引用 No.2098-2 - 2008/10/10 (金) 22:32:31 - AP Bluntingして入れるのも大して難しくないので、それでもいいと思います。 ただ、SphIは3'突出なので、T4 pol（KODとかPfu polも使えますね）で削ることになりますが、3'陥没末端をfill-upするより少しばかりトリッキーです。 別の方法がとれるかどうかは、まずインサートの両端として選べる制限酵素サイトは何があるかによります。ベクターにクローニング済みのものを切り出すとしたら、cloning siteのなかで候補があるかどうか。PCRでプライマーに制限酵素サイトをつけるのなら自由度が高いですね。 例えばインサートの末端のBamHIのかわりにBglIIにできればBamHIとコンパチブルです。SphIにはそういうのがないので、Bluntingするしかないとしても、directional cloningは出来るし、両方ともbluntよりかなり効率が高くなるでしょう。

クローニング 削除/引用 No.2098-1 - 2008/10/10 (金) 21:53:49 - クー ベクター側のクローニングサイトとして、SphI とBamHI しか使えません。 しかし、クローニングするフラグメント中に SphIサイトが２カ所、BamHIサイトが１箇所あります。 こういう場合、ベクターとフラグメントをブラントエンドにしてクローニングするのが 最良の方法でしょうか？ 他に、良い方法があれば伝授下さい。 お願いします。

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