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(無題) 削除/引用 No.2096-7 - 2008/10/12 (日) 18:12:35 - くるまど >手間は増えますが有効な手法の一つと思います。形質転換株の再形質転換など、良好な生育状態を必要とする場合に行うことがあります。 聞いたことのない方法だったので不安だったのですが、試してみたいと思います。 >既製品の栄養追加サプリメントもあります。 これも初めて聞きました。わたしと同じような問題を抱えている方にはかなり使われているものなのでしょうか。探してみたいと思います。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2096-6 - 2008/10/11 (土) 18:35:22 - みかん >プラスミド脱落の割合が少ないとすると、最少培地で本培養してから、２時間くらいＹＰＤで本培養してみてもいいかもしれませんね。聞いたことのないやり方ですが・・・ 手間は増えますが有効な手法の一つと思います。形質転換株の再形質転換など、良好な生育状態を必要とする場合に行うことがあります。 また、最小培地に厳密な意味での栄養要求性がない種々のアミノ酸や核酸、ビタミンを加えた培地でも栄養不足による生育遅延をかなり解消できます。もちろん、ロイシン、ウラシルはのぞいておきます。自作もできますし、既製品の栄養追加サプリメントもあります。難点は高価なことで、研究の最終目標が工業化だと考えものですね。

(無題) 削除/引用 No.2096-5 - 2008/10/11 (土) 17:57:41 - くるまど URAマーカーのついたプラスミドに２つ、LEUマーカーに１つの遺伝子がのったプラスミドを酵母に入れています。 このプラスミドを活かしてＹＰＤ培地で培養できないかと考えたのですが、難しそうですね。 プラスミド脱落の割合が少ないとすると、最少培地で本培養してから、２時間くらいＹＰＤで本培養してみてもいいかもしれませんね。聞いたことのないやり方ですが・・・ とりあえずプラスミドを変える仕事と並行してもう少し方法を考えてみようと思います。まだ何かアドバイスがあればよろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.2096-4 - 2008/10/11 (土) 09:55:48 - 弘法 脱落はひちみさんのお書きになっているように分裂に伴って起こるもので、どのようなベクターをお使いなのかわかりませんが、安定なもので分裂あたり１パーセント以下、そうでなくとも数パーセント以下です。ですから、選択を外した条件下で数回分裂しても９割以上の細胞はプラスミドを保持していることになります。 YPD培地で選択を掛けるには、おおさんのお書きになっているようにG418耐性などの選択マーカーを使うという手もあります。また、例えばウラシル取り込みに関与するトランスポーターFUR4の破壊株を使えば、YPD培地でもURA3プラスミドの選択を掛け続けられます。

(無題) 削除/引用 No.2096-3 - 2008/10/11 (土) 09:31:01 - ひちみ 酵母の培地組成や選択マーカーやプロモーターについてよく知らない素人ですが、 >培養実験開始時の酵母が栄養不足に こういう抽象的なことではなくて、上の要素と絡んでくる転写レベルでの事象と 考えれば、リッチな培地で一時的に転写制御を解いてやることは有効と思われます。 プラスミドの脱落という現象は細胞分裂に伴う再選択だと思うのですが、同調培養 でない限り、どんな短時間の処理でも一部の細胞に脱落はおこると考えるのが 妥当でしょう。と、なるとプラスミドを使った細胞を使って行う一時的な転写制御 解除処理は全ての工程の培養条件を厳密にコントロールしないと、最後の発酵試験 での再現が難しいと予想されますね。

(無題) 削除/引用 No.2096-2 - 2008/10/11 (土) 04:57:17 - おお こうせい物質のマーカーがはいったプラスミドを使うのは考えてないのでしょうか。

プラスミドの脱落 削除/引用 No.2096-1 - 2008/10/10 (金) 20:07:57 - くるまど 酵母の培養実験を行っています。 実験は糖を発酵させて、代謝産物の測定を行うというものです。 発酵効率のよい株を育種することが研究の目的です。 これまでは遺伝子を染色体に組み込んだ株を用いていたため、リッチなＹＰＤ培地で前培養、本培養後に最少培地にて培養実験をしてきました。 最近、さらにプラスミドを導入することにより、発酵効率をあげる試みをしていますが、最少培地で前培養、本培養しないとプラスミドの脱落が起こるということなので、すべて最少培地を使うようになりました。 しかし、最少培地で前培養、本培養を行うと培養実験開始時の酵母が栄養不足になっているためか、ＹＰＤ培地を使っていたときほどの発酵効率が出せなくなりました。 現在はどうにかしてＹＰＤ培地で前培養、本培養したいと考えています。 このような場合、プラスミドとして導入している遺伝子を染色体に組み込む以外に何か方法は考えられないのでしょうか。導入したい遺伝子が多いのでどうしたものかと思っています。 １．ＹＰＤ培地でも〜〜時間までならばほぼプラスミドの脱落は考慮しなくてよい ２．最少培地に〜〜を添加するとよい など、意見がありましたら、どうぞよろしくお願いいたします。

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