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(無題) 削除/引用 No.2095-8 - 2008/10/21 (火) 10:56:47 - ＩＲＥＳ その用いている細胞がlipofectionに適応しているかどうか調べる必要がありますね。GFPやなければ他の発現することがハッキリしているプラスミドを用いてlipofectionして十分に遺伝子導入できるかどうか調べてください。 十分に入らないようであればウイルスやエレクトロポレーションなどによる導入を選択するべきです。同じプラスミドを作製するにしても、ウイルスを用いるのであればウイルスベクターに目的遺伝子を組み込んだ方が二度手間にならずに済むでしょう。

皆様 削除/引用 No.2095-7 - 2008/10/21 (火) 10:26:48 - ぷるこ お礼が遅くなり、申し訳ありません。 stable株もできること、やっと理解できました。 （3'LTRにpolyAが入っていることを知りませんでした・・・） 皆様の言う通りです。 指導教官にマップをくださいと頼み続けて半年が過ぎ・・・ いよいよ疑い始めているところでした。 （だからここに質問させてもらいました） 今扱っているプラスミドに目的のｃDNAが入っているのか PCRで確かめたりもしました。（確認はできました） シークエンスを読みたいというと断固反対されるし・・・ もう、訳がわかりません。 この2週間、他所の研究室にお願いして違うベクターを 3種類入手しました。 頑張ってプラスミドを作そうと思います。 まだ研究を始めたばかりなので、また質問させてください。 よろしくお願いします。

同感 削除/引用 No.2095-6 - 2008/10/10 (金) 23:54:30 - あべちゃん >[Re:5] ＩＲＥＳさんは書きました : > いや、この話だと一生懸命トランスフェクトされているplasmidと思われているものが実はvirus particleだったという可能性もありますね... > 私もIRESさんに同感です。 非常に大切なポイントなので、その指導教官の方にちゃんと聞くべきですね。 プラスミドDNAなのかウイルスを含む培養上清なのか。

(無題) 削除/引用 No.2095-5 - 2008/10/10 (金) 22:53:40 - ＩＲＥＳ いや、この話だと一生懸命トランスフェクトされているplasmidと思われているものが実はvirus particleだったという可能性もありますね...

(無題) 削除/引用 No.2095-4 - 2008/10/10 (金) 20:51:13 - student > “もうウイルスの力価が落ちてるから、ただのDNAとして扱え”といわれました。 > 私の勉強不足かも知れませんが、訳がわかりません。 確かにこの意味は不明です。 パッケージング細胞とプラスミドがあれば作り直せるはずですが。 ちなみに私はレトロウイルスベクターでもトランスフェクションでpuro耐性の安定発現株を取ったことあるので、トランスフェクションでもできます。

(無題) 削除/引用 No.2095-3 - 2008/10/10 (金) 18:43:42 - 禿 プロモーターもpoly Aサイトも持っている訳ですから、puro耐性マーカーを持ったただの発現ベクターとして扱うことができます（できないと考える理由は何でしょうか？）。「ウィルスの力価云々」というのは意味不明ですが。

(無題) 削除/引用 No.2095-2 - 2008/10/10 (金) 18:41:44 - taka 通常の発現ベクターと同じように安定発現細胞を作ろうということではないでしょうか？ 対象の細胞次第では大丈夫かもしれませんが、レトロウイルスの形にした方が導入効率は高いと思います。 インテグレーションも保証されるでしょうし。

レトロウイルスベクタープラスミドのトランスフェクション 削除/引用 No.2095-1 - 2008/10/10 (金) 18:30:15 - ぷるこ いつも勉強させて頂いております。 今年から実験を始めた超初心者です。 ヒトの不死化細胞株にある遺伝子を導入し安定発現株を作りたいのですが、 成功しません。 最初は私もど素人だったので、指導教官に言われるがまま もらったプラスミドをトランスフェクションしていましたが、 失敗を重ねるうちに疑問を感じ、調べていくうちに妙なことに気づきました。 レトロウイルスベクタープラスミドをヒト細胞株に直接トランスフェクションさせて、安定発現株を作ろうとしていたのです。 指導教官にパッケージング細胞にトランスフェクションしなくて良いのかきくと “もうウイルスの力価が落ちてるから、ただのDNAとして扱え”といわれました。 私の勉強不足かも知れませんが、訳がわかりません。 レトロウイルスベクタープラスミドをヒト細胞株にいくら導入しても 一過性の発現しかしないのでは・・・？と思っています。 ちなみに使用しているベクターは、pBabe-puroです。 すごく基本的な質問で申し訳ないのですが、どなたかお教え願えないでしょうか？ よろしくお願いいたします。

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