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(無題) 削除/引用 No.2089-9 - 2008/10/15 (水) 09:27:30 - EcoRI BamHI様 詳しい説明に感謝します。 >上手くいけば、少ない試料量、2〜3回程で測れると思うよ。 >健闘を祈ります。 ありがとうございます。 がんばります。

(無題) 削除/引用 No.2089-8 - 2008/10/14 (火) 20:40:00 - BamHI LCなら 移動相A：0.1% ギ酸 移動相B：0.1% ギ酸/80% アセトニトリル カラムはペプチドが測れるODS。 流速：0.2 mL/min カラム温度：40℃（〜60℃） time A B 0分 95% 5%　･･･ ちょっとACN入れて(B conc. 2〜10%？？) 10分 95% 5%　･･･ カラムの長さによる 90分 40% 60%　･･･ ACN Conc.が40〜60%位で大体溶出すると思う。 　　　　　　　　　　時間はカラムの長さにもよる。 大体分かれると思うけど・・・？？？ 込み合った所はいくつかピークが重なって、 綺麗に分かれないかもしれませんが。 一回はLCで流し見ないとパターンも分からないし、 配列か完全に未知なら、 MS/MSの時のプリカーサーイオンの質量も分からないし･･･ 上手くいけば、少ない試料量、2〜3回程で測れると思うよ。 健闘を祈ります。

(無題) 削除/引用 No.2089-7 - 2008/10/14 (火) 13:34:58 - EcoRI aji様、ありがとうございます。 言葉足らずで申し訳有りません。 解析したいサンプルは複数種あって、それらの分子量はかなり近接している、 (1D-PAGEではなかなか難しい、分離できないわけではないですが) そして、いずれもN末が読めなかった、ということです。 ですから、うまく分離してゲル内消化し、MSで解析しようということなのです。 >2つのバンドがあったら出来るだけ片方を含むゲル断片と出来るだけもう片方だけを含むゲル断片の両方をそれぞれ分析して、ピークの強弱で調べたい方のペプチドを選択します。人によっては隣のブランクのレーンからゲルを切り出し、バックグランドとして扱う場合もあります。 あぁ、これはいいですね。自分の手技の首尾のチェックにもなりますね。

(無題) 削除/引用 No.2089-6 - 2008/10/14 (火) 12:48:00 - aji > LC-MS/MSについてですが、LCの条件検討のために、サンプルが割とリッチにないと、苦しい > ということになりますね。 LCの条件検討といってもペプチドなので、そんなにバリエーションがあるわけでもないでしょう。ゲル内消化して、その中の何かと何かを分けたいかなんてあまり出会う状況ではないと思います。 あと、一回に必要なサンプル量は装置にも拠りますので、装置と相談してください。 > MALDIはちょっと苦しいかな、と思っています。 > 解析したいサンプルの分子量がかなり接近していますので。 > IEF-SDS-PAGEでうまく分かれてくれればと思うのですが。 消化前に少しでも分かれたほうがありがたいですね。状況が理解出来ないのですが、N末解析で読めなかったからという事なので、混ざっている物もN末が読めなかったということではないのですか？それとも目的物ではない、既知の別物なのでしょうか。 LC-MS/MSだとLCによって各溶出時間でのサンプルに含まれるペプチドの種類が少ないので重なりが大幅に解消され検出したペプチドの分子量が正確に出ます。そしてMS/MSでそのアミノ酸配列がほぼ分かります。ところが、元々一つのはずのスポットから複数のタンパク質由来のペプチドが検出されたらそれぞれのアミノ酸配列からどのようなタンパク質の混合物かは分かっても自分が知りたいタンパク質かどうかはMSで分かるところではありません。 2つのバンドがあったら出来るだけ片方を含むゲル断片と出来るだけもう片方だけを含むゲル断片の両方をそれぞれ分析して、ピークの強弱で調べたい方のペプチドを選択します。人によっては隣のブランクのレーンからゲルを切り出し、バックグランドとして扱う場合もあります。 同じ発想で、MALDIでもピークの選択がある程度可能です。しかし間違いなくLC-MS/MSがお勧めです。

(無題) 削除/引用 No.2089-5 - 2008/10/14 (火) 11:55:47 - EcoRI BamHI様 ありがとうございます。 それぞれの長所、短所がよくわかります。 LC-MS/MSについてですが、LCの条件検討のために、サンプルが割とリッチにないと、苦しい ということになりますね。 MALDIはちょっと苦しいかな、と思っています。 解析したいサンプルの分子量がかなり接近していますので。 IEF-SDS-PAGEでうまく分かれてくれればと思うのですが。

(無題) 削除/引用 No.2089-4 - 2008/10/14 (火) 00:12:20 - BamHI LC-MSは、LCで分離した各ピークをMSで測定する。 MALDI-TOF-MSは、試料とMatrixを混合してMSで測定するバッチ法。 LC-MS 長所：混在する試料をLCで分ける為、単一試料の測定が可能になる。 　　　フラグメントのスペクトルからアミノ酸配列が分かる。 短所：LCの分離条件を作らないといけない。 　　　LCに注入するだけの体積が必要。 MADLI-TOF-MS 長所：試料とMatrixと混ぜて、プレートにスポットするだけの操作。 　　　試料体積がごく少量（例：1μL）で測定はできる。 短所：混在する試料だと、どれが目的とするピークか分からない。 　　　フラグメントの質量は分かる。 　　　 データベースにあるようなタンパク質ならMALDIでも良いと思うが、 未知なものならLC-MSを薦めますね。 ゲル消化の部分はやったことなので、そこはごめんなさい。

(無題) 削除/引用 No.2089-3 - 2008/10/13 (月) 12:34:57 - EcoRI -様、ありがとうございます。 もうすこしレスがたまってから、返答しようと思っていたのですが。。。 >とにかくin gel digestionの際にケラチンのコンタミをさせないことが重要になります とありますが、 -様は、LC-MS/MS, MALDI問わず、MSサンプルを作るときは、どのように行っておられますでしょうか？ 手袋をして、ピペット類はきれいに拭いて、チップやチューブは専用のものを用意する といったことをすればよろしいのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2089-2 - 2008/10/09 (木) 13:49:56 - - もしLC-MS/MSが利用可能なのであれば、MALDIよりもそちらをおすすめします。 多少ケラチンやnon-specificなタンパクのコンタミがあったとしても、確実に同定できます。 ただ、CBBでクリアな単一バンドとして見えているということなので、そこにタンパクが１種類しかないのが確実であれば、MALDIでも問題ないかもしれません。 とにかくin gel digestionの際にケラチンのコンタミをさせないことが重要になります。

LC-MS/MS, MALDI-TOF-MS 削除/引用 No.2089-1 - 2008/10/09 (木) 13:35:37 - EcoRI いつもお世話になっております。 タンパク質のN末の配列を解析したところ、ブロックされているようなので、 内部配列を解析することにいたしました。 トリプシンでゲル内消化を行ったあとの消化産物の解析ですが、 LC-MS/MSやMALDI-TOF-MSの両者が高感度で迅速である、という情報を得ました。 MSは扱ったことが無いです。 みなさんにお伺いしたいのは、LC-MS/MSもしくはMALDIの利点や欠点を教えて頂きたいのです。 たとえば、キットがないとサンプルの調製がめんどう、とか、消化産物のロスが少ないとか MSサンプルの調製で注意すべきことなどです。 サンプルの量は、CBBではっきり見えるぐらいあるので、 量的な問題はクリアできると思います。

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