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(無題) 削除/引用 No.2083-9 - 2008/10/09 (木) 05:33:08 - Y > 逆にBamH1 siteのコドンが(g-gat-cc)となる場合や、(gg-atc-c)の場合には２塩基もしくは１塩基をそれぞれ挿入してから目的のinsertを付ければよいということになるのですね。 BamH1 siteのコドンが(g-gat-cc)の場合：BamHIのあとに１塩基挿入 BamH1 siteのコドンが(gg-atc-c)の場合：BamHIのあとに２塩基挿入 です。念のため。

(無題) 削除/引用 No.2083-8 - 2008/10/08 (水) 05:41:46 - 分子生物学かけだし おおさん とても助かりました。 ありがとうございました！！

(無題) 削除/引用 No.2083-7 - 2008/10/08 (水) 01:52:52 - おお >[Re:4] 分子生物学かけだしさんは書きました : > この理解でよろしいでしょうか？ > 多分お分かりになったのではと思いますので、これ以上くどくどとかきません。 GFPとインサートのフレームが一致してないとフュージョンができないということです。

(無題) 削除/引用 No.2083-5 - 2008/10/08 (水) 01:44:02 - 分子生物学かけだし APさん >終止コドンから後ろは、翻訳されないので何塩基であろうが関係ないはず。 これもとても気になっていた点です。 教えていただきありがとうございますn(__)n

(無題) 削除/引用 No.2083-4 - 2008/10/08 (水) 01:41:18 - 分子生物学かけだし おおさん その通りです！ GFPがついています。GFPの頭にATGがついています。 GFPの後ろにMulti Cloning SiteがあってBamH1やEcoR1やXho1やNot1などがあります。 GFPのATGから始まって、BamH1 siteは(gga-tcc)というコドン２つに２分されているので、この場合であれば目的のinsertはATGを除いてdirectにfusionしても問題ないのですね。 逆にBamH1 siteのコドンが(g-gat-cc)となる場合や、(gg-atc-c)の場合には２塩基もしくは１塩基をそれぞれ挿入してから目的のinsertを付ければよいということになるのですね。 この理解でよろしいでしょうか？ おおさんのアドバイスでなんとなく理解できたようにも感じますが。。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.2083-3 - 2008/10/08 (水) 01:33:07 - AP プロモータと開始コドンはベクター側にあり、それに続くORFをBamHIで切って、そこにインサートのBamHI末端をつなげたとき、ベクターのORFとインサートのORFはちゃんとin-frameになるかどうか、ということだと思います。 重要であるはずの、この点に関係する情報が、質問の書き込みではすっかり抜けているのですが、考慮されていますでしょうか。 終止コドンから後ろは、翻訳されないので何塩基であろうが関係ないはず。

(無題) 削除/引用 No.2083-2 - 2008/10/08 (水) 01:03:56 - おお ATGを除いてますよね(除く理由があるかどうかは置いておいて)。ということは、きっとその上流にタグかなんかがあって、そのタグにATGがあると思えますがどうでしょうか。 そうそると、その上流のATGから始まるフレームがインサートしたものとあってないといけないという事だとおもいますが。 タグでなくてなにか故意的にフュージョンさせているかもしれませんが、それでも同じことですね。

遺伝子のクローニングの時にフレームを気にする理由 削除/引用 No.2083-1 - 2008/10/08 (水) 00:52:20 - 分子生物学かけだし いつもとても勉強になっております。 最近、遺伝子を扱うようになった修士２年です。 現在、いただいたレトロウイルスベクターに、自分の入れたい遺伝子をPCRで増やしてベクターにつなげたいと考えています。 まずPCRの設計には、GG+制限酵素配列（例えばBamH1 site）+ATGを除いたCDS配列の20 bps分の合成28bp をprimerとして、reverse primerは｛終止コドンから5'側20bp+制限酵素配列（例えばEcoR1）+GG｝これの相補的なprimerをreverse primerとしてPCRをかけ、予想通り一本のバンドが検出されました。 これをゲルから抽出して…と実験を進めようとしています。 ここで、質問なのですが、先輩からフレームシフトが起こらないようにprimerを設計しなさいといわれました。 この意味がいまいち理解できずにいます。今晩考えて、明日、先輩に聞いてみようと思っていますが、その前に皆様に聞いていただければ幸いです。 まず疑問はフレームシフトが起こる条件ってなんだろうということ。 �@ATG（３塩基）を除いている。 �A終止コドンのすぐ次に制限酵素配列をつけている。 これならば３の倍数できれいにベクターにつながると思うのですが。 フレームシフトをきにしなければならない時は、例えば、終止コドンの次に１ or 2塩基加えて制限酵素配列をつなげた場合だけだと思うのですが、 僕の場合の、終止コドンの次にdirectに制限酵素配列をつけていたり、あるいはreverse primerを終止コドンの次に0 or 3 or 6 or 9 or 3n...の塩基の挿入であればフレームシフトは起こり得ませんよね？ こういった理解でよろしいでしょうか？ なぜこんなことを、真剣な顔して「フレームシフトに注意するんだよっ！！」と先輩が言った理由がわかりません。もしかしたら、僕が考えていること以外に、先輩は注意してほしい点があるのかもしれないと、考えると夜も眠れません。何か自分が見逃しているというか、気づいていない何かがある気がしてなりません。。 どうか教えてくださいn(__)n

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