全9件 ( 1 〜 9 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.2073-9 - 2008/10/09 (木) 23:01:48 - 初心者 皆さま、ご丁寧に教えていただいて、ありがとうございました。基本的なところで困っていたのですが、とてもすっきりしました！　いろいろ試して練習してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2073-8 - 2008/10/08 (水) 14:01:32 - おお >[Re:7] 初心者さんは書きました : > いろいろ教えていただき、ありがとうございます。やはり解凍後すぐの細胞はよりやさしく扱うことに気をつけた方がよいようですね。 > 細胞保存液の残存が特に影響しているわけではなさそうだと考えよいでしょうか？。FreshのPBMCの洗浄も同じようにやっていますが、それでは特に問題なくできていて、解凍時の洗浄のときにだけ、ときどきペレットの凝集が起きてしまうことから、保存液の影響が気になっておりました。 > > 凝集してしまうのは、一つの理由として細胞が死んでしまっている可能性があります。そういう場合は細胞の塊というより、繊維がからまったような感じに見えることがあります。 凍結によるダメージか、凍結する時に用いた細胞があまり調子よくなかったか、あるいは凍結保存には不向きなのかもしれません。DMSOを5%ぐらいに下げるとか、細胞凍結用保存液を買うなどで若干凍結のダメージは抑えられるかもしれません。わたしは10%DMSOですが、残り90%は血清で凍結しています。 多分ご存じと思いますが、凍結は徐々に温度を下げる方がダメージがなく、融解するときは37度で直ぐに溶かして、バイチなどできしゃくするのがいいとされています。 私はバイチを温めておいて、温めたバイチを凍結チューブに注ぎ、ピペッティングしながら、すぐに溶かすようにしています。 そのあと大抵は遠心して回収しますが、一度回収した細胞の生存率をその時チェックした方がいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2073-7 - 2008/10/08 (水) 13:11:34 - 初心者 いろいろ教えていただき、ありがとうございます。やはり解凍後すぐの細胞はよりやさしく扱うことに気をつけた方がよいようですね。 細胞保存液の残存が特に影響しているわけではなさそうだと考えよいでしょうか？。FreshのPBMCの洗浄も同じようにやっていますが、それでは特に問題なくできていて、解凍時の洗浄のときにだけ、ときどきペレットの凝集が起きてしまうことから、保存液の影響が気になっておりました。

ちょっときつくないですか？… 削除/引用 No.2073-6 - 2008/10/07 (火) 18:17:00 - mom-a G = 1.12 × 10-5 × ｒ × rpm2　ですから、1800rpmだと、ざっと1200rpmの2倍以上Ｇがかかる計算になります…。（1200rpmというのは、私のこれまでの経験での最高速度です。）解凍直後にトリプシン処理というのも、ちょっと可哀相な感じが…。DMSOの影響を心配しなくて良い場合であれば、おおさんがおっしゃるように、洗浄しないで一日培養することもあるくらいですから、解凍直後のサンプルはなるべくおだやかに扱ってあげた方が良いのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2073-5 - 2008/10/07 (火) 17:26:30 - Acena+Demina PBMNCのマクロファージや好中球が凝集しているのではないでしょうか？そういった場合、固まったペレットにトリプシン処理されて、ほぐれたものを蒔くのはいかがでしょうか？標準的な遠心機であれば1800回転はそんなに強い条件ではないと思いますよ。

1200rpmくらいで 削除/引用 No.2073-4 - 2008/10/07 (火) 16:42:36 - mom-a 論文等でＧで表記せずにrpm表記が多いのは、ほぼ同じサイズのスイングローターを使っているというのが暗黙の了解になっているのでしょうね。 PBMCの凍結-再解凍はしたことがないですが、PBMCを遠心するときは1200rpm,10minにしていました。これで充分落ちるはずです。解凍時なら、5min程度にしておいた方が良いかも、と思うくらいです。時間を長くしないと心配なら、とりあえず5min遠心して細胞を取っておき、上清をもう一度遠心して細胞があるかどうか確かめてみては？

(無題) 削除/引用 No.2073-3 - 2008/10/07 (火) 09:30:24 - student おおさんと同じ意見ですが、１８００rpmは細胞が潰れている可能性があります。 少ない細胞を低速で落とすためのコツというか、 そもそも細胞ほど大きいものであれば1000-1200rpmぐらいあれば落ちます。 1800rpmでも落ちないものがあるのであれば、それはおそらく死んだ細胞のカスみたいなものが浮いているのではないでしょうか？ 細胞を遠心せずにチューブに入れて５分ほど置いているだけでも細胞が底に大分溜まりますし。

(無題) 削除/引用 No.2073-2 - 2008/10/07 (火) 07:25:42 - おお 1800回転ってどれくらいのgがあなたの遠心で出ているか分かりませんが 強すぎませんか?細胞同士が接着しているというより、つぶれてしまって いるようなきがします。 継代や、その他の実験でそれぐらいの遠心で調子のいい細胞が取れますか? たいてい遠心は800-1000gで細胞を回収するのは一般的なプロトコール だとおもいます。で多分これは細胞の数にはそんなに影響なく落ちてくる と思います。まずは標準のプロトコールでやってみることをお薦めします。 もしどうしてもそれでも調子が悪いなら、バイチで解凍したものを10-20倍 にうすめてそのまま1日培養して翌日バイチをかえるというのも選択肢か もしれませんが、DMSOとかの影響も考慮しないといけないかもしれません。 接着細胞ではうすめてそのまま蒔いて、数時間後接着を確認してバイチ をかえる方法を取る人がいるようです。同様にしてコラーゲンでコート した物にまいて接着させてという応用が考えられますが、どうでしょう、 今回のばあいは細胞株でないですし選択アツがかかるような気がしますね。

凍結細胞融解後の洗浄について 削除/引用 No.2073-1 - 2008/10/07 (火) 06:12:15 - 初心者 いつもお世話になっております。 実験初心者につき、たいへん基本的な質問で申し訳ありませんが、凍結細胞の融解後の洗浄につき、質問させてください。 HumanのPBMCを、10%DMSO加の凍結保護液で凍結保存し、実験に使っています。融解時は、恒温槽で融解後、すぐ別のtubeに移して、cold mediumを加え、遠心器にかけています。ここの遠心で、1800回転７分（細胞数が少なかったので、ぜんぶ確実に落としたいと思い、やや高速でまわしたのです）でまわしたところ、ペレットが固まってしまって、細胞をほとんど回収できませんでした。手元の実験書を読むと、解凍後の洗浄は、1000回転で４〜５分と低速、短時間になっています。そこで、、 1．凍結保存細胞の融解後の洗浄においては、やはり低速で遠心する方が、細胞の接着を防ぐためによいのでしょうか？ 2．低速でまわすとしても、少ない保存細胞をできるだけ多く回収するために、なにかよい工夫はありますでしょうか？ 本当に基本的で申し訳ありません。なにとぞご教示のほど、よろしくお願い申し上げます。

全9件 ( 1 〜 9 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---