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(無題) 削除/引用 No.2066-5 - 2008/10/06 (月) 19:11:34 - ニコニコ ありがとうございます。 やはり「急がば回れ」ですね。 精製はちゃんとやるとして、とりあえずダメモトで1種のみと2種同時の両パターンでトランスフェクトしてみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2066-4 - 2008/10/06 (月) 18:24:07 - student 効率は使用する遺伝子によりますが、 例えば一つの安定株を作るのに10000個の細胞にトランスフェクションしてコロニーを２４個取ったとして、そのうち３個が目的に合う発現をしたとすると、それを同時に二種類で行っても両方の遺伝子が望ましい発現をしている確率はかなり低いと思います。 とにかくいそいでいるのであれば、１種類のクローニングと２種類同時のクローニングをやってみてもよいとは思います。 エタ沈などでもできなくはないかもしれませんが、 ある程度の効率は落ちる可能性があるかもしれません。 やったことないのでわかりません。フェノクロぐらいしてほしい。 少なくとも、数十分ぐらいのことをケチってクローニングをやり直す手間を考えれば、 精製ぐらい行って損はないと思います。 たまにこの掲示板でもクローンが取れなくて困るヒトがいるように、なかなかクローニングがうまくいかない場合があります。そういった時にトラブルシューティングしやすいように、できることはちゃんとやっておいたほうがいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2066-3 - 2008/10/06 (月) 17:42:05 - ニコニコ 情報ありがとうございます。 欲しいのは高発現クローンなので、やはりLinearizeした方がよさそうですね。 2）についてですが、カラム精製の代わりに、制限酵素を熱で失活させたり、単純にエタ沈ではまずいでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2066-2 - 2008/10/06 (月) 16:54:42 - ~ どのような株の取得を目指しているのでしょうか。 1） 別にlinearizeしなくても入ります。 私は(別の細胞でですが)経験上linearizeした方が発現量が高かったので、 高発現のものをとりたければ切ります。 2） 切れ残りのベクターはそれほどinhibitoryには働かないでしょう ただ、使用する遺伝子導入法で、今回用いる酵素やバッファーがトランスフェクションに影響しないかが調べられていないでしょうから、最低限(電気泳動はせずに)カラム精製します。 3） 高発現クローンが欲しいのであれば、両方同時に入れて、両方とも求めるだけの発現量になる組み合わせを探すよりかは、 片方入れて高発現のものを選んで、2回目にもう一方を入れる方が効率がいいかと思います。 もしかしたらうまくいくかもしれませんので、片方ずつ入れる際に、一緒に入れてみてはいかがでしょうか。

ダブルトランスフェクションで安定発現株 削除/引用 No.2066-1 - 2008/10/06 (月) 16:13:07 - ニコニコ A遺伝子とG418耐性酵素を持つプラスミドと、B遺伝子とBlasticidin耐性酵素を持つプラスミドがあり、これら両方を同時に安定に発現する細胞を作りたいと思います。 この場合、 1）プラスミドはLinearizeしなくてはなりませんか？ 2）Linearizeした場合、ゲル抽出などでそれを精製しなくてはなりませんか？ 　切れなかったプラスミドや制限酵素が残ったままではまずいでしょうか？ 3）A遺伝子とB遺伝子は、二つ同時にトランスフェクトしてもよいですか？ 　それとも、一つずつ耐性株を取っていかなくてはなりませんか？ なんとなく、制限酵素で切ったAとBをそのままトランスフェクトすれば、ヘテロなコンカテマーができて一発でダブルの安定発現株ができそうな気もしないではないですが、認識が甘いでしょうか？ なお、細胞株は今のところCOSを予定していますが、その他の細胞でもかまいません。 よろしくお願いします。

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