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3T3-L1でのnon-RI EMSA（ゲルシフトアッセイ） トピック削除
No.2063-TOPIC - 2008/10/06 (月) 11:21:44 - パロンパロン
現在、私はnon-RIでゲルシフトアッセイ（EMSA）を行っております。
3T3-L1を核抽出し、それをビオチン染色したprobeでEMSAし、検出しております。
バンドらしき物は出るのですが、coldでも非常に多くのバンドが出てしまい、WT probeを用いた際に特異的に出るバンドもcold probeやmutation probeで追い出しができないという状況です。因みにスーパーシフトもうまく行っていません。

うまく行かない原因が、3T3-L1の核抽出にあるのか、もしくはnon-RIで行うゲルシフトアッセイにあるのかも特定できないままです。

特に私が伺いたいのは
@分化させた3T3-L1の核抽出は、他の細胞と同様の手法で核抽出をしては弊害が生じるのか？
A3T3-L1をnon-RI（ビオチン）でEMSAを行うと問題が生じるのか？
という点です。


実際に似たような実験をされていらっしゃる方、また、私に似た経験をされて、克服された方など、御助言頂けると非常に助かります。
　
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(無題) 削除/引用
No.2063-6 - 2008/10/06 (月) 14:29:46 - AP
ビオチンは内在的に存在していて、カルボキシラーゼの補酵素になっていたりしますから、それを検出しているとか？　

免疫染色の場合、内在性のビオチンをブロックする処理をかませることもあります。Gel shift assayだとin vtroでbiotinylated-probeとextractを混ぜるので内在性だけを選択的にブロックするのは難しそうです。DIGでやるシステムもありますが。

(無題) 削除/引用
No.2063-5 - 2008/10/06 (月) 14:20:54 - AP
>coldでも非常に多くのバンドが出てしまい、

coldのプローブ、つまりラベルしていないプローブでも、バンドが出るというように読めますが、そういうことですか？


>WT probeを用いた際に特異的に出るバンドもcold probeやmutation probeで追い出しができないという状況です。因みにスーパーシフトもうまく行っていません。

とにかく、プローブを全く入れないで、lasateだけのときとは見えないバンドが見えるというのは確かなのですよね。そのバンドは、non-specificなキャリア（poly (dI-dC)など）を増やしても消えないものですか？

(無題) 削除/引用
No.2063-4 - 2008/10/06 (月) 14:18:24 - fish

L1を用いたEMSAやChIPを行ったことがあります。
isotopeを用いたEMSAでは特にトラブルはありませんでした。核抽出でも特に問題はないと記憶しております。

今回は、核抽出以前に、coldで多くのbandがでるのであれば、系として成立してないと思います。isotopeを用いた実験に変更されたらどうでしょうか？

施設の問題で、isotopeを使用することができないのであれば、そのビオチンのキットを使用した既報の再現実験を行うのはどうでしょうか?
workするはずのpositive control的な実験を行ってから、L1に移られる法が良いと思います。

また、私感ではございますが、EMSAはあくまで確認的な実験だと思いますのでそこまでこだわらなくても他の実験がworkしていればOKだと思います。
(functionalではないintronに存在するコンセンサス配列の周辺の配列を取り出してEMSAをしますと、functionalであろうがなかろうが転写因子が結合すると思います。したがってsi実験やlucの実験、ChIPの実験が最も重要かと思います。)

追加 削除/引用
No.2063-3 - 2008/10/06 (月) 14:08:50 - りょう
調製された核蛋白に興味対象の蛋白が有意なレベルで存在しているのか？

(無題) 削除/引用
No.2063-2 - 2008/10/06 (月) 14:06:36 - りょう
分化させた3T3L1だから上手くいかないということはないと思います。

non RIだから上手くいかないということはないと思います。

3T3L1で既に証明されているオリゴDNAのポジコンを立ててください。

他の細胞でのポジコンを立ててください。

これらを検討すれば腕が悪いのか、細胞種が悪いのかは明らかになるでしょう。勿論RIの方が感度良いでしょうからnon RIでは検出限界以下になってしまうものもあるでしょう。

3T3-L1でのnon-RI EMSA（ゲルシフトアッセイ） 削除/引用
No.2063-1 - 2008/10/06 (月) 11:21:44 - パロンパロン
現在、私はnon-RIでゲルシフトアッセイ（EMSA）を行っております。
3T3-L1を核抽出し、それをビオチン染色したprobeでEMSAし、検出しております。
バンドらしき物は出るのですが、coldでも非常に多くのバンドが出てしまい、WT probeを用いた際に特異的に出るバンドもcold probeやmutation probeで追い出しができないという状況です。因みにスーパーシフトもうまく行っていません。

うまく行かない原因が、3T3-L1の核抽出にあるのか、もしくはnon-RIで行うゲルシフトアッセイにあるのかも特定できないままです。

特に私が伺いたいのは
@分化させた3T3-L1の核抽出は、他の細胞と同様の手法で核抽出をしては弊害が生じるのか？
A3T3-L1をnon-RI（ビオチン）でEMSAを行うと問題が生じるのか？
という点です。


実際に似たような実験をされていらっしゃる方、また、私に似た経験をされて、克服された方など、御助言頂けると非常に助かります。
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