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(無題) 削除/引用 No.206-8 - 2007/11/03 (土) 04:02:03 - おお > 現在、0.5NのNaOHを使用していますが、細胞成分が一部、 > 固体として残存し、均一な溶解液になりません。 単純に過熱してみてはどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.206-7 - 2007/11/02 (金) 19:56:58 - 小児科医師（ゆとり教育） ご回答、ありがとうございます。 　現在行っている実験は、腎細胞１ｇあたり・・・ngのTGF−β産生が 見られたということを調べています。界面活性剤NP40やトライトンを 使用すると、骨格蛋白や核蛋白など可溶化しにくい蛋白は抽出できない ため、正確に腎細胞の量を定量することができません。もちろん、 ウェル間の細胞量の比較だけであれば、その方法でも十分可能だと 思います。NaOHですと、骨格蛋白や核蛋白などもある程度可溶できると 書いてある論文があり、NaOHを使用しています。 　おそらく、NP40やトライトンの濃度を上げれば、そのような蛋白も かなり可溶できると思います。しかし、タンパク定量する時に高い 濃度のNP40やトライトンはかなり吸光度に影響を与えるとBioradの説明書に書いてあったので使用しませんでした。デオキシクオール酸ナトリウム＋ ベンゾネース、ソニケーションという方法もよさそうですね。

(無題) 削除/引用 No.206-6 - 2007/11/02 (金) 13:49:46 - りょう 確かに、なぜNaOHなのか？ RIを取り込ませた時の細胞溶解は0.5N NaOHで行い、液シンカクテルと混ぜて測定したことはあります。 その手の実験をやってられるのかなあ・・・・？？？ 僕の場合、そのinternal controlとして細胞数が一定であることを示すために、蛋白濃度を測定しましたが、それは別プレートを用意しておき、PBS,0.5%NP40なんかで可溶性蛋白を調製し、濃度測定してました。 厳密に考えると0.5%NP40ごときで骨格蛋白や核蛋白など可溶化しにくい蛋白は抽出されにくいわけですが、細胞数の比較という観点では、可溶蛋白のみの比較で十分と考えて行いました。

(無題) 削除/引用 No.206-5 - 2007/11/02 (金) 13:26:33 - NUPD そうですね。界面活性剤、ソニケーションが一般的だと思います。 ウエスタンで核酸が残って粘性が出た時などは シリンジで上下してブチブチにしてみたりソニケーションで 壊してみたりしますし。 それ以前になぜNaOHにこだわっておられるのかが興味が出てきました(笑) NaOHでタンパク回収というのはあまり聞いたことがないので。 MTT(個人的にはWSTのほうが楽で好きですけど)などは駄目でしょうか？ また脂肪細胞の場合DNAを回収してトータルDNA量を細胞数の 指標にしたりもしてますけど。 色々な方法がある中でNaOHを選択された理由を 今後の参考までにお聞きしたくなりました。 よかったら教えていただけませんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.206-4 - 2007/10/31 (水) 18:55:19 - ああ 核を溶かすのに界面活性剤NP40やトライトンで溶解してはダメですか？？ 細胞膜はデオキシクオール酸ナトリウムでとけます。 後はベンゾネース、ソニケーションとかすればペレットにはタンパク質ほとんどなくなると思うのですが。。。

(無題) 削除/引用 No.206-3 - 2007/10/31 (水) 18:50:10 - 小児科医師（ゆとり教育） ご返答、ありがとうございます。 追加でお聞きしたいことがあるのですが、一般的に 細胞の核酸はNaOHでは溶解しないものですか？

(無題) 削除/引用 No.206-2 - 2007/10/31 (水) 06:04:04 - NUPD Why don't you try WST-1 or MTT assay? I think WST-1 is easier than your protocol. If you want to lyse cells, I think it's better to use lysis buffer for some experiments like western.

細胞を溶解する 削除/引用 No.206-1 - 2007/09/18 (火) 15:20:02 - 小児科医師（ゆとり教育） ６ウェルのプレートに細胞（腎尿細管細胞）を培養しています。 細胞を溶解してそのタンパク量を測ることで、各ウェルに存在する 細胞量を定量したいと考えています。 現在、0.5NのNaOHを使用していますが、細胞成分が一部、 固体として残存し、均一な溶解液になりません。NaOHの量を増やすと 細胞は溶解するのですが、あまりのNaOHの量を増やしたくありません。 細胞を溶解するよい方法はないでしょうか？

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