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(無題) 削除/引用 No.2057-22 - 2008/10/07 (火) 11:09:24 - panda >Bが生化学的に合成されて上がっているのであれば、FACSの定量より、局在の確認のほうがプライオリティーが高いような気がします。 FACSだと結局細胞膜以外のほかの場所としか言い用がないですよね。そのデーターでは局在をいうには乏しいですし、レビューアーから突込みが入るようなきがします。蛍光顕微鏡を使わないのは何か理由がありますか? 可也基礎的なデーターがそろっているのであとは局在を明確にするだけで(定量はもうしているわけですし)、 一つストーリーがかけるような気がします。 刺激でBを合成する酵素遺伝子の発現がmRNAレベルであがっていることは確認しました。 ただ、Cは細胞膜に発現していますが、その発現がより上昇することはありませんでした。 Bは膜上には検出されないので、細胞内で定量したいんです。Bの細胞内の定量はまだです。 もちろん局在は顕微鏡下でみてみる予定でいます。細胞をすりつぶしてTLCで展開してBを定量するのも手ですが、精製にいくつものstepがありとても定量を議論できそうにもありません。 最大の目的はBを合成する酵素遺伝子量が刺激であがる意義を知りたいんです。 刺激でmRNAレベルではありますがBを合成する酵素遺伝子はあがっていた。でもBは膜上には検出されない。かといってCは膜には検出されますが、Cが増えてる訳でもない。。 この疑問を解決したいんです。 Bに対する抗体はFACSで使えます。 Bをdominantに発現する細胞にてちゃんとdetectできます。 Bを作る酵素遺伝子KOマウスではそのシグナルは消えますのでFACSには使えると思っています。 >APさんが指摘するPLP固定はいいと思いますが、、、、 PLP固定、調べてみます！ありがとうございます！！ studentさん >確かにブロッキングは必要だと思います。 FACS用のブロッキングは分りませんが、 私が免染に用いているのは 3%BSA/PBS 30min 室温 とか 10% Goat Serum/PBS　30min 室温とかです。 backが高くなる以上、blockingは試さなければなりませんね、いろいろ試してみます！ 同時並行で顕微鏡下での観察をおこなってみます！！

(無題) 削除/引用 No.2057-21 - 2008/10/07 (火) 10:20:21 - おお >[Re:17] pandaさんは書きました : > > あっ、ちなみにvitroで細胞をすりつぶしてTLCで展開するとBのbandはみえましたので、おそらく細胞内の｛どこか｝で発現はしてるんだと思います。ただ細胞膜には検出できないと。 > > なのでFACSを使いたいです。 Bが生化学的に合成されて上がっているのであれば、FACSの定量より、局在の確認のほうがプライオリティーが高いような気がします。 FACSだと結局細胞膜以外のほかの場所としか言い用がないですよね。そのデーターでは局在をいうには乏しいですし、レビューアーから突込みが入るようなきがします。蛍光顕微鏡を使わないのは何か理由がありますか? 可也基礎的なデーターがそろっているのであとは局在を明確にするだけで(定量はもうしているわけですし)、 一つストーリーがかけるような気がします。 APさんが指摘するPLP固定はいいと思いますが、、、、 あと気になるのですが、抗体をFACSで利用する時、蛍光顕微鏡などで、スペシフィックを拾っていることを示さなくて良いのでしょうか(FACSで使えるという実績がない抗体で)?

(無題) 削除/引用 No.2057-20 - 2008/10/06 (月) 16:25:11 - student 早いですね。もう実験されていましたか。 確かにブロッキングは必要だと思います。 FACS用のブロッキングは分りませんが、 私が免染に用いているのは 3%BSA/PBS 30min 室温 とか 10% Goat Serum/PBS　30min 室温とかです。 ここで確認しておきたいのは、 まずどこが一番染まっているかどうかなのですが。 ゴルジも染まってなおかつ細胞質が染まっているので、ブロッキングでゴルジの染まりを特異的にしたいというのであればよいのですが、 例えば核のみに強いシグナルしか見えないとかだと、それ以前の問題だと思いますが。 FACS用に残ったサンプルをスライドに乗せて６０倍ぐらいの顕微鏡で見てみてはいかがでしょうか？

やってみました。 削除/引用 No.2057-19 - 2008/10/06 (月) 15:02:23 - panda 今回、ネガコンとしてcontrol IgG from murine serum（sigma）を用いました。 細胞はジギトニンなど条件を検討したかったので、酵素�@は正常にもってる細胞(cell line)で行いました。 脂質Bに対する抗体のサブクラスはmouse IgG3です。 条件をお示します。 �@固定：４％ PFA, 10 min, r.t →wash �A膜透過性処理：ジギトニン 0.01-0.5 %, 5 min, on ice �Bwash後、1 st Ab, 5 ug/ml, 45 min, on ice �Cwash後、and Ab-PEラベル, 45 min, on ice �Dwash後、FACS analysisです。 結果です。 固定はして、膜処理をしなかったものは、蛍光のシフトは予想通りみられませんでした。 固定処理して、膜処理をすると確かに蛍光のシフトはみられましたが、control IgGでもシフトしてしまいました。 考察です。 最大の問題は一次抗体の非特異的な吸着です。 �@blockingの必要性 �Acontrol IgG from murine serumをやめて、［control IgG3｝にしてみる。 今回、blockingはしておりません。 blockingをFACSの操作の時、どのようにやるべきなのでしょうか？ どうか引き続きご教示くださいn(__)n

(無題) 削除/引用 No.2057-18 - 2008/10/06 (月) 13:43:02 - panda いい忘れてしまいましたが、刺激で�@のmRNAはあがりましたが、細胞膜上の脂質Cの発現は増強されませんでした。 なので、細胞内の脂質Bがあがってないかを調べることが目的です。

(無題) 削除/引用 No.2057-17 - 2008/10/06 (月) 13:40:29 - panda いろいろな方からアドバイスをいただいて、とても幸せです。ありがとうございます。 現在、GFP融合タンパクとして糖転移酵素を発現させ、GFPは予想通りgolgiに局在しておりました。 反応系を書きます。 脂質Aーーー糖転移酵素�@ーーー>脂質Bーーー別の糖転移酵素�Aーーー>脂質C 糖転移酵素�@を遺伝子工学的になくした細胞に入れていますので、脂質B, Cはこの細胞でないことは確認しています。 野生型の細胞ではCが細胞膜に出ていましたが、Bは検出できませんでした。 この細胞ではおそらく、A--B--Cまではゴルジで合成され、選択的にCだけが細胞膜にsortされているんだと推測することができます。 逆に、AやBは細胞内（ゴルジを予想しています）に検出できるのではないか。と考えております。 Bに対する抗体は、Bを膜に発現している細胞に大してきちんとFACSできます。PFA固定でも大丈夫だと確認しています。 あっ、ちなみにvitroで細胞をすりつぶしてTLCで展開するとBのbandはみえましたので、おそらく細胞内の｛どこか｝で発現はしてるんだと思います。ただ細胞膜には検出できないと。 なのでFACSを使いたいです。 ELISAはサンドイッチの系が動いていないので、現実的に厳しいです。 定量性のあるdataを出したいのでFACSを適用して、刺激ありなしの脂質Bの発現をみてみるつもりです。 実は今、ジギトニンで濃度を振ってFACSをやっているところです。今２nd Ab中なので、結果が出たらまたお知らせいたします。 皆様、本当にありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.2057-16 - 2008/10/06 (月) 12:44:20 - AP >糖脂質がプレート吸着するかなっと、、、2種類抗体があればサンドイッチでできますが、、、 脂質との疎水結合でポリスチレンプレートにくっつかないこともないみたいですね。シリカゲルコーティングしたプレートを使ってELISAする方法も報告があるようです。

(無題) 削除/引用 No.2057-15 - 2008/10/06 (月) 12:12:17 - ひちみ 糖脂質ならTLCで展開した後に染色できると思いますよ。 糖脂質全部を染めたり、抗体糖のプローブで発色させたりと方法はあると思います。それなりに実験書も出てたと思います。 ビトロで発現を確認されるのが先ではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2057-14 - 2008/10/06 (月) 11:24:45 - おお >[Re:13] うううさんは書きました : > ELISAじゃだめなんでしょうか？ その手はあるかもしれないと思ってましたが、糖脂質がプレート吸着するかなっと、、、2種類抗体があればサンドイッチでできますが、、、

(無題) 削除/引用 No.2057-13 - 2008/10/06 (月) 10:52:08 - ううう ELISAじゃだめなんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2057-12 - 2008/10/06 (月) 09:43:26 - AP 糖タンパク質ならともかく、糖鎖や糖脂質はPFAでは固定されず、界面活性剤の浸透化処理で逃げてしまいますよ。PLP固定なんかが良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.2057-11 - 2008/10/06 (月) 09:33:21 - AP いきなりFACSをやるより、まずその抗体を使ってICCをして、染まるかどうか、コントロールと差が出るかどうか、固定や浸透化などの条件はどうしたらいいかなどを検討した方がいいのではないでしょうか。それとも、もうしていらっしゃる？ ICCでは、ゴルジに局在する糖やタンパク質の抗体やレクチンなどを使って、localizeするような実験は数多く例があるような気がするのですか。それらでは染色ができかつゴルジの形態を保持するような処理がされているはず。 それができたら、 >現在、注目している分子をFACSでみている前例はございません。 初の試みとしてチャレンジするもよし、 FACSなど、近代兵器をつかわずとも、定性実験はICCで、定量実験はRIAやELIAで良いような気もします。

(無題) 削除/引用 No.2057-10 - 2008/10/06 (月) 09:12:44 - おお >[Re:7] pandaさんは書きました : > 何度もすみません。 > > FACSを用いるというのは、恒常的にその糖脂質は細胞内に発現しているはずなんです。 > > なので、恒常的なレベルから、刺激によりどれほど上がるかを調べてみたいんです。 > > なので、普通の顕微鏡下での免疫染色では定量性を論ずることはできないので、FACSを適用できないかということでトピックを立てました。 > まずは染めれるかどうか蛍光顕微鏡で確認してからそれに近い方法でFACSするのが無難でしょうか、、、 ゴルジにあるという前提も、合成酵素がそこにあるというだけで、その後輸送されているかもしれませんし。

(無題) 削除/引用 No.2057-9 - 2008/10/06 (月) 09:04:07 - student Tritonでももちろんうまくいく可能性はあります。 例えばＥＲの内側にあるタンパク質などはtritonでＥＲ膜に穴を開けないと染色することができません。そのような染色はdigitoninではできません。 ゴルジはdigitoninでも十分だったと思いますが、一応両方試してみてはどうでしょうか？ とりあえず免染できるかどうか検討してみてください。

(無題) 削除/引用 No.2057-8 - 2008/10/05 (日) 21:39:23 - おお 糖脂質ならそめれるかもしれませんね。ちょっとまえに、糖などのを見る時にPFAよりいい固定法があると書き込みがあったと記憶しています。ちょっと検索してみてはどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2057-7 - 2008/10/05 (日) 19:54:58 - panda 何度もすみません。 FACSを用いるというのは、恒常的にその糖脂質は細胞内に発現しているはずなんです。 なので、恒常的なレベルから、刺激によりどれほど上がるかを調べてみたいんです。 なので、普通の顕微鏡下での免疫染色では定量性を論ずることはできないので、FACSを適用できないかということでトピックを立てました。 自分の伝達能力のなさ、情けないです。 どうか、みなさまのご意見を引き続き宜しくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.2057-6 - 2008/10/05 (日) 19:50:50 - panda みなさん、コメントありがとうございます。 いくつか自分の発言で誤っているところがありました。 >膜の透過性を高めて、固定後、抗体を用いて染色してみます。 これは間違いでした。逆で、固定後、透過性を高めます。 >>それは要するにあるタンパク質の発現上昇を見たいのですよね？？ >はいその通りです。言葉足らずで申し訳ありません。 これも間違いです。蛋白ではないです。糖脂質です。 バイトの休憩中にトピックを立ててしまい、意識朦朧としていたんだと思います。誤った書き込みをして申し訳有りません。 まとめます。 刺激により発現誘導（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより確認済み）されたゴルジ局在糖転移酵素が、糖を転移して糖脂質を作ってくれていないか期待してFACSを行いましたが、少なくともFACSでは検出できませんでした。もしかしたら細胞内で（ゴルジを想像しています）上がっているのでは？と期待して細胞内染色を行おうとしています。 普通に細胞膜上に発現する糖脂質はPFAで固定できます。が、ゴルジに局在しているのかもしれない物を透過性を高めてFACSできないかということでトピックを立てました。自分の言葉足らずでご迷惑をおかけして申し訳ありません。 ジギトニンにはそういう働きがあるんですね。ありがとうございます！！ ぜひトライトンではなくジギトニンで検討してみます！！

(無題) 削除/引用 No.2057-5 - 2008/10/05 (日) 19:09:04 - おお 糖の合成なのでしょうか、、糖の合成はかなりが細胞質で行われていてその後、UDP が付加されて細胞膜をまたいで、小胞体やゴルジにいこうするのだとおもいますが ただしゴルジで合成される糖もあるようですね。ちょっと整理したいのですが、 お考えの糖は、たんぱく質に付加された糖を考えているのでしょうか(つまり RTPCRでたんぱく質に糖さを築く酵素なのでしょうか)それとも、グルクロン酸 など、糖自身を作る酵素なのでしょうか、でその酵素はゴルジに局在することが 分かっているのでしょうか、、、、 いろいろ興味本位で聞いてしまいましたが、きっと書き込みをする人がそれぞれ 違うことを想像してアドバイスするようなきがしました。 糖さが付加されたたんぱく質であれば、糖さに対しての抗体(抗体のできによりますが)でウエスタン、 免疫染色とおそらくFACSで検出できると思います。 単糖の検出は難しいかもしれませんが、私の知識が至らないだけかもしれません。 わたしがこのてのことをするのであれば、まずその酵素の局在をしめして(もうすでに やっているかもしれませんが)糖じしんはライセートをとって、糖の検出をするかもしれません (HPLCとかでしょうか、、、)

(無題) 削除/引用 No.2057-4 - 2008/10/05 (日) 17:47:23 - student > > >>TritonでなくともDigitoninの方がよいなとか思います。 > どうか、Tritonでなくてジギトニンを用いた方がよいとするわけを教えていただけないでしょうか、基本的な事がわかっておらず情けないですが、、 Tritonは細胞内のほとんどの膜に穴を開けますが、digitoninは基本的には細胞膜だけなので、Tritonに比べればマイルドです。 でも染色するのが目的であれば固定後に透過処理をすれば済むことだとも思うのですが、特殊な抗体ということなんでしょうか？ > なので、糖はゴルジで作られますので、細胞膜にあがってきてなくてもゴルジ膜で糖が発現誘導されているのでは？と考え、細胞内ＦＡＣＳを行おうとしているんです。うまくいくかはわかりません。 糖というのは要するにタンパク質の糖鎖になるような糖ということですよね。そのような糖に対する抗体で染色するわけですね。 糖鎖の染色であればPAS染色などが考えられますが、主に組織切片の糖タンパク質とか腸のような糖鎖タンパク質が多い細胞を染め分けるのに使用されている方法があります。ただ糖のみは染色できるのかどうか覚えていませんが。 そもそも、一つ疑問なのは糖は固定できるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2057-3 - 2008/10/04 (土) 22:05:03 - わお >>それは要するにあるタンパク質の発現上昇を見たいのですよね？？ はいその通りです。言葉足らずで申し訳ありません。 >>TritonでなくともDigitoninの方がよいなとか思います。 どうか、Tritonでなくてジギトニンを用いた方がよいとするわけを教えていただけないでしょうか、基本的な事がわかっておらず情けないですが、、 >>ＷＢやれば済む問題のように思いますが、なぜFACSの必要があるのでしょうか？ 実は糖を作る酵素がある刺激でmRNAレベルであがっていたので、糖が出来ているのでは？と期待して通常のＦＡＣＳを行いましたが発現は見られませんでした。 なので、糖はゴルジで作られますので、細胞膜にあがってきてなくてもゴルジ膜で糖が発現誘導されているのでは？と考え、細胞内ＦＡＣＳを行おうとしているんです。うまくいくかはわかりません。 糖ですのでＷＢではみれません。が、抗体ができたのでＦＡＣＳでみてみようと考えてここで、私が抱える疑問点につき、質問させていただきました。 細胞内サイトカイン染色でＦＡＣＳで細胞内ＩＬ−４とか見ますよね、あのようにゴルジに局在しているかもしれない糖をtime courseでみてみたいんです。

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