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相変わらず・・・ 削除/引用 No.2046-18 - 2008/10/03 (金) 17:19:19 - DDD とりあえず、こういう解釈でいいのでしょうか？ SacB遺伝子が乗っているプラスミドを回収。 大腸菌に形質転換。 スクロース含有プレートに播く。(プラスミドに乗っている抗生物質も含む？) 抗生物質により、SacBプラスミドが含まれていない大腸菌は生えてこない。 SacB遺伝子が入っている大腸菌はスクロース代謝物の毒性のため生えてこない。 SacBプラスミドが導入された大腸菌∧トランスポゾンによってSacB遺伝子が 破壊された形質転換株の大腸菌のみコロニーを形成する。 こんな流れでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2046-17 - 2008/10/03 (金) 14:59:29 - 匿名希望 大腸菌の扱いに詳しい方に確認してもらったところ、一部はコンタミ、一部はコンラージ棒でプレートを傷つけたしまった結果、コンタミのように表面が割れているのではということでした。 未熟者なので何がなんだかわからないうちに書き込んでしまって済みませんでした。今度は周囲にも意見を伺ってそれでもわからないとき書き込みたいです。 もっと内容のある質問ができるように実験頑張って生きたいと思いますのでまた書き込んだ際はよろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.2046-16 - 2008/10/03 (金) 11:46:22 - 匿名希望 ＞~ さん 　そのため、 　スペクチノマイシン感受性の大腸菌に、 　スペクチノマイシン耐性"ではない"プラスミドを入れて、 　スペクチノマイシンプレートに撒いているのですよね。 　この実験の目的は何ですか？ 　確かに生えてくるのはおかしいですが、 　この実験自体が、形質転換してもコロニーが生えてこないのを見るための　実験なのですか？ 　(スペクチノマイシンがどのくらい安定か知りませんが、失活するまで3日　以上位37度でインキュベートしているわけではありませんよね) 皆さんおっしゃられているように実験の目的がよくわかっていないのかもしれません、実際質問するにも何を聞けばよいかすらよくわからずここに書き込みました。皆さんの意見をいただいて何を聞くべきかようやくわかってきました。 この実験はSacBを持ったプラスミドを大腸菌とは別の菌に形質転換してその後プラスミドを抽出します。このプラスミドを大腸菌に形質転換してコロニーPCRにつなげたいのです。欲しいプラスミドSacBがトランスポゾンが入って遺伝子が破壊されることでSucrose耐性を持つコロニーを得られるはずなんですが…

(無題) 削除/引用 No.2046-15 - 2008/10/02 (木) 22:22:22 - AP 確認してみたら、スペクチノマイシンはaminocyclitol系というやつでで、耐性遺伝子はアミノグリコシド系のとは別ものでした。失礼しました。

(無題) 削除/引用 No.2046-14 - 2008/10/02 (木) 21:08:22 - SPEC スペクチノマイシンは耐性株がすぐ出てくる感じがします。 コンタミというよりはただの耐性菌ではないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2046-13 - 2008/10/02 (木) 20:57:43 - T 推測ですが、pUC19 は形質転換効率のチェックに使っただけでは？ "cfu/μg pUC19" を単位として使う事はよくありますよね。 スペクチノマイシンは Invitrogen の Gateway システムで使われることがあるようです。

(無題) 削除/引用 No.2046-12 - 2008/10/02 (木) 20:11:09 - AP スペクチノマイシンて、分子遺伝学でよく使われるものではないのでよくわからなかったのですが、調べてみるとアミノグリコシド系ですね。カナマイシンやネオマイシン、Geneticinの仲間なので、カナマイシン耐性やネオマイシン耐性の選択に使われるべきものなのではないでしょうか。pUCの選択はアンピシリンなので意味不明です。 それなら、形質転換体も含め、全く生えてこないのが正解のはず。 それが生えてきた原因として考えられそうなのは、他の方の指摘の他に、抗生物質が壊れているという可能性もあります。粉であってもストック溶液であっても保存期間が長かったり、保存が不適切であると分解して効かなくなることは良くあります。

(無題) 削除/引用 No.2046-11 - 2008/10/02 (木) 19:16:01 - ひちみ 大昔の嫌な思い出が蘇ってしまった。 形質転換後のレスキュー用のSOC培地をラボの後輩が何度もコンタミさせやがって、薬剤耐性の正体不明のバクテリアが生えてきたことが何度もありました。

形質転換 削除/引用 No.2046-10 - 2008/10/02 (木) 18:48:27 - DDD GEさんがおっしゃられているように、まずは形質転換について 正しく理解してから質問されるべきだと思いますね。 一応最後に、一通り説明だけさせていただきます。 形質転換株をとるということは、その大腸菌が保有していない 抗生物質を含むプレートにまくことになります。 そうでなければ、形質転換させなくても大腸菌は増殖してしまいます。 形質転換させることで、抗生物質を含むプレートにコロニーが生えてくるわけです。 今回pUC19を使用されているとのことですので、この場合プレートに添加すべき 抗生物質はアンピシリンとなります。(pUC19にはアンピシリン耐性遺伝子が 含まれています。つまり形質転換させた場合にはアンピシリン耐性にしか 成り得ません。他の抗生物質を添加させた場合は、pUC19を用いて形質転換 させていようが、コロニーは生えてきません。) pUC19を用いてアンピシリンプレートに藩いて、ネガコン(ヒートショックによる 形質転換を行っていないもの)と同等のコロニーが生えてくるようならば、 それはコンピテントセルが原因だと考えられます。 先ほど、コンピテントセルについてコメントさせてもらいましたが、 原因はわかりませんが、形質転換させていないにもかかわらず、 本来持たない抗生物質耐性菌がコンタミしている場合があります。 ですので、コンピテントセルを作製する場合は、大元がコンタミしてないか をきちんと確認して作製にとりかかる必要があります。 それを疑ってのコメントでした。 身近にこういう初歩的な質問をできる方はいないのでしょうか？ 本を読んでも理解できない場合は、先輩やスタッフの方に聞いたり するのも手だと思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.2046-9 - 2008/10/02 (木) 17:44:03 - GE 匿名希望さんの回答から察するに、実験目的や手技を理解していないように見受けられます。学生さんでしょうか？ こういった場合、ここで質問するよりも先輩に質問するか、実験初心者向けの実験本（遺伝子工学実験ノート、バイオ実験イラストレイテッド、等）を購入して一読することをおススメします。 基本的知識が無い状態でここで質問しても匿名希望さんが完全に理解するための回答は得られないと思いますし、それよりも、本を読んだほうが時間の節約にもなります。

(無題) 削除/引用 No.2046-8 - 2008/10/02 (木) 17:34:36 - ~ >[Re:7] 匿名希望さんは書きました : >自分はコンピとして使った菌DH5αは少なくともスペクチノマイシン耐性がないと思い込んで DH5aはスペクチノマイシン耐性ではありません。 有名どころではXL1-Blueはテトラサイクリン耐性です。前に失敗したことがあります。 > 一応確認したところ、アンピシリン耐性のみです。 アンピシリン耐性遺伝子はβラクタム系用なので、アミノグリコシド系抗生物質であるスペクチノマイシンは分解できないと思います。 そのため、 スペクチノマイシン感受性の大腸菌に、 スペクチノマイシン耐性"ではない"プラスミドを入れて、 スペクチノマイシンプレートに撒いているのですよね。 この実験の目的は何ですか？ 確かに生えてくるのはおかしいですが、 この実験自体が、形質転換してもコロニーが生えてこないのを見るための実験なのですか？ (スペクチノマイシンがどのくらい安定か知りませんが、失活するまで3日以上位37度でインキュベートしているわけではありませんよね)

(無題) 削除/引用 No.2046-7 - 2008/10/02 (木) 17:13:09 - 匿名希望 ＞1つ確認したいのですが、pUC19ってスペクチノマイシン耐性遺伝子が乗っ　ていませんよね? 一応確認したところ、アンピシリン耐性のみです。 http://detail.chiebukuro.yahoo.co.jp/qa/question_detail/q1219584017 のチェック方法はどうなったのですか？ ＞プレートを使い切ってしまったので今日確認作業をすることができませんでした。そのためいろいろ調べてみたところです。

(無題) 削除/引用 No.2046-6 - 2008/10/02 (木) 17:05:27 - 匿名希望 ＞コンピはラボの作り置きとのことですが、 　そもそも、このコンピが抗生物質耐性の菌から作製している可能性は 　ないでしょうか？ 　コンピ作りの際に、いくつかの抗生物質耐性でないことを 　確認して作製にとりかかったものなのでしょうか？ 実験者として未熟なもので、この質問にすら正しく答えられず、むしろ失礼な質問をしてしまうかもしれません。お許しください。 自分はコンピとして使った菌DH5αは少なくともスペクチノマイシン耐性がないと思い込んで実験してしまっていましたが、一般的にコンピに使われるDH5αやJM109などはそれぞれ抗生物質耐性が違っているものと理解してよいのでしょうか？その辺の知識すらないのでなんとも言えません。

(無題) 削除/引用 No.2046-5 - 2008/10/02 (木) 16:55:43 - GE ~さんとかぶってしまいました。 基本的に形質転換効率が低下しているなら、コンピを作り直したほうが方が早いのでは。その際、抗生物質に耐性を持ってないことをあらかじめ確認しておいた方がいいと思います。 余裕があれば、市販の安いコンピを買ってポジコンにすることをお勧めします。

(無題) 削除/引用 No.2046-4 - 2008/10/02 (木) 16:47:04 - GE pUC19だったら抗生物質はアンピシリンではダメなのでしょうか？ スペクチノマイシンはどのように作用するのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2046-3 - 2008/10/02 (木) 16:44:19 - ~ 1つ確認したいのですが、pUC19ってスペクチノマイシン耐性遺伝子が乗っていませんよね? http://detail.chiebukuro.yahoo.co.jp/qa/question_detail/q1219584017 のチェック方法はどうなったのですか？ >コンラージ棒を加熱殺菌しているのでコンタミは考えたくないです 現在薬剤耐性菌がコンタミしていて、混入経路は不明なんですよね。 殺菌後に菌が残っていないことを確認していないのに、考えたくないはないでしょう。

そもそも 削除/引用 No.2046-2 - 2008/10/02 (木) 16:21:43 - DDD コンピはラボの作り置きとのことですが、 そもそも、このコンピが抗生物質耐性の菌から作製している可能性は ないでしょうか？ コンピ作りの際に、いくつかの抗生物質耐性でないことを 確認して作製にとりかかったものなのでしょうか？

形質転換について 削除/引用 No.2046-1 - 2008/10/02 (木) 16:06:09 - 匿名希望 最近E.coliで形質転換を行っています。 方法はヒートショック、大腸菌はStrain: E. coli DH5α 形質転換効率：4.3×10の7乗 cfu/μg pUC19です。 プラスミドを入れていないネガコンももちろん用意して行いました。ところがネガコンにもコロニーが現れ、そして肝心な形質転換体があまり得られず、菌そのものの形質転換効率が悪いのか？とまで疑いたくなりました… プレートは最近作ったものなので古いことが原因ではないと思います。 ちなみに作り方は以下の通りです。抗生物質はスペクチノマイシン、濃度は100μg/mlです。オートクレーブしたLB培地に冷めてから抗生物質を加えています。（行ったのは手で触れるくらいの温度だったので、完全に冷めてからでないと抗生物質が分解されてしまうのでしょうか？） 形質転換方法はヒートショック法（学生実験レベルの簡易な方法です）で、かつプレートにまくときはコンラージ棒を加熱殺菌しているのでコンタミは考えたくないです。それでもコンタミしうるのでしょうか？ コンピはラボの作り置き（春ごろのものです）で-80℃保存でした。日数が経過しているので効率は多少落ちますが、コンタミと何か関係あるのでしょうか。

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