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ありがとうございました 削除/引用 No.2044-6 - 2008/10/03 (金) 06:30:18 - 初心者 早速のレス有難うございました。 いろいろな方法があるのですね。 是非試してみます。

(無題) 削除/引用 No.2044-5 - 2008/10/02 (木) 18:41:41 - A コロニーPCRでよいのでは？ どの向きのクローンが欲しいのかによりますがたとえば Template :拾ったコロニーを100uLのDDWに溶いた溶液 Forward Primer:ベクター由来のForward側のuniversalプライマー Reverse Primer:クローニングしたPCR産物のreverseプライマー でコロニーPCRすれば予想されるPCRシグナルが得られたものが 目的のクローンです。25uLの系で十分ですから結構な数拾えると 思います。コロニーPCRをオーバーナイトで仕掛けて残った template溶液を使って同時にミニカルチャーを仕掛けておけば 翌日にコロニーPCRの結果を確認して当たりのクローンのみ ミニプレップしてシークエンスで確認という感じに進められます。

(無題) 削除/引用 No.2044-4 - 2008/10/02 (木) 09:59:33 - おお クローニング(サブクローニング)はパズル的な要素がありますので、いろいろ考えてみたらと思います。プラスミドをとって、ミニプレップしたあとインサートの中に１個所以上あり、3'末端と5'末端のフラグメントの長さが違う断片を生じる制限酵素を使う。その制限酵素はベクターに少なくとも1個所以上の切断部位があることが望ましいが、そうでなければベクターを切るがインサートを切らない酵素とコンビネーションでつかう。 この様な処理で生じたプラスミドの断片は方向によって長さが変わるので、どのように入ったのか見分けがつく。 あるいはインサートないとベクターないのプライマーでPCRする。 インサートが入った場合片方だけがベクター/プラスミドのジャンクションに制限酵素認識配列ができるようにする。プラスミドを精製してからでも確認がしやすいですし、うまく設計していれば、ライゲーションごその制限酵素できって、制限酵素認識配列ができないものだけがトランスフォーメーションされるようにする手もかんがえられます。 でも、PCRフラグメントを挿入するなら配列を確かめるでしょうし、シーケンスで確かめても良いかと思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.2044-3 - 2008/10/02 (木) 09:53:04 - AP 制限酵素の切断パターンで見るというのがポピュラーではないでしょうか。 制限酵素地図を作る方法を知っているなら、それの簡単な応用です。 たとえば、ある制限酵素サイトが、ベクターのクローニングサイトに一箇所と、インサートの片側から1/3のところに一箇所あるとします。その制限酵素で切断した時のパターンは、インサートの向きのよって、 ・[ベクター　＋　1/3インサート]　と [2/3インサート] ・[ベクター　＋　2/3インサート]　と [1/3インサート] になって区別が出来ます。

(無題) 削除/引用 No.2044-2 - 2008/10/02 (木) 08:53:33 - ~ 目的の向きとは逆に入った場合に、 コロニーが出来てこなくなるという方法はpGL3にはありません。 (そのようなベクターを私は知りません) 選択する方法としては、 制限酵素断片長で調べる PCRで増えるサイズを調べる はあります。

インサート向き選択法 削除/引用 No.2044-1 - 2008/10/02 (木) 08:12:15 - 初心者 全くの初心者です。 pGL3-vectorに、あるPCR productをTA cloning後に組み込む実験を予定しています。 PCR productをある方向でベクターに組み込みたい時、2つのPCR primerに予め異なる制限酵素部位を付加する方法があるのは知っています。 それとは別に、一旦組み込んだ後に目的の方向に組み込まれたもののみを選択出来る方法ってあるのでしょうか? 基本的な事ですいません。 どなたか教えて下さい。

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