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みなさまありがとうございます 削除/引用 No.2043-7 - 2008/10/02 (木) 22:45:44 - si太郎 みなさま様々なご意見ありがとうございます。 実はsiRNAの実験は初めて間がないので、タンパク量を見てノックダウンを確認することやノックダウンしてからのルシフェラーゼアッセイはまだできていません。 やはりRNAレベルのみではなく、タンパクレベルでの確認が必要ということを痛感しました。 「片方のノックダウンした方はBの発現が低下していたのですが，もう片方が逆に上昇していました」についてお伺いしたいのですが、このようなことが起こる理由としては私が考えたこと以外に何か原因として考えられるでしょうか。 引き続きご助言いただければありがたいです。 何卒よろしくお願いいたします。

ポジコンはどうですか？ 削除/引用 No.2043-6 - 2008/10/02 (木) 11:46:20 - fish 転写因子Aで調節される、既知のポジコン遺伝子はどうでしょうか？ あと、指摘にもありますが、si-Lucを僕もします。

(無題) 削除/引用 No.2043-5 - 2008/10/02 (木) 10:41:29 - おお まずAのタンパクの確認をしたほうがいいですね。で時間に関してはなるべく、しっかりとタンパクが減少しているところでみるのがいいと思いますので、それを考慮に入れると時間はたんぱく質の量をモニターしながら決めるのがいいと思います。 ただし、今回の場合作用が見れている可能性がありますので、それが十分な作用であればオフターゲットなどの可能性をひていするデーターを取ることを考えた方がいいかと思います。 もう指摘がありますように、特にBの発現が下がった方でそのRNAiに耐性のAを発現するとかがいいと思います。 RNAiをもちいた実験でプロモーターアッセイはしてますか?

(無題) 削除/引用 No.2043-4 - 2008/10/01 (水) 15:34:58 - AP siRNAの設計の段階でよくよく検討されているとは思いますが、オフターゲットになりそうな類似遺伝子はありませんか。その遺伝子の産物がAに競合してBの転写をブロックしているものだったりして（だったらもうけものかも）。

(無題) 削除/引用 No.2043-3 - 2008/10/01 (水) 15:26:40 - SI ノックダウンは蛋白レベルで確認されたのですか？ そうであれば、（１）の可能性はないと思いますし、転写因子の重要性を論じるなら蛋白レベルでのノックダウンを証明しないとだめですよね。

(無題) 削除/引用 No.2043-2 - 2008/10/01 (水) 15:15:25 - student 転写因子のノックダウンはやったことないので、一般的な範囲で答えると、 > （１）インキュベートの時間が短く転写因子Aがまだ残存している→72，96時間と延長してみる ノックダウンによってmRNAが分解されるのが２４−４８ｈだと思うので、実際にタンパク質の減少のピークが見られるのは４８−７２ｈ頃だと思います。タンパク質の半減期によっても変わります。まずは目的の遺伝子が最も減少が見られるかをタイムコースを振って決めたほうがよいです。２−５日ぐらいで。 > （２）siRNAに問題（オフターゲット効果の出方が異なる？）→siRNAを変えてみる（会社含め），しかし値段が張る オフターゲットが気になる場合は、siRNA処理した細胞にＷＴの遺伝子を戻して、細胞のフェノタイプも戻るかどうか検討することで、そのフェノタイプが目的の遺伝子のノックダウンであることを確認することも出来ます。 > （３）AはBの転写調節に実は関与していない→あきらめる？ 実験の結果がクリアーに関与していないことを証明したのであればそうすることになります。

siRNAによるノックダウンについて 削除/引用 No.2043-1 - 2008/10/01 (水) 14:49:25 - si太郎 みなさまお世話になります。 培養細胞でsiRNAを使った実験を始めたところです。 培養細胞に発現している遺伝子A（転写因子）をsiRNAでノックダウンした時に，遺伝子Aが転写調節をしていると思われる遺伝子Bの発現がどのように変わるかを定量PCR（TaqMan）で確かめるという実験をしています。転写因子Aの結合部位がBのプロモーター上に存在し，同部位に変異を導入したレポーターベクターではルシフェラーゼ活性が低下すること，またゲルシフトアッセイでAが同部位に結合することはsupershiftを含め確認済みです。 Invitrogen社のstealth select RNAiをlipofectamine RNAiMAXでトランスフェクションし，stealth select RNAi 3種のうち2種で遺伝子Aが60-70%ノックダウンすることが出来ました。 この状態でBの遺伝子発現を定量PCRで確認すると，片方のノックダウンした方はBの発現が低下していたのですが，もう片方が逆に上昇していました。siRNAの量，インキュベートの時間なども振っても（時間は24，48時間）同じ結果でした。 この原因として， （１）インキュベートの時間が短く転写因子Aがまだ残存している→72，96時間と延長してみる （２）siRNAに問題（オフターゲット効果の出方が異なる？）→siRNAを変えてみる（会社含め），しかし値段が張る （３）AはBの転写調節に実は関与していない→あきらめる？ などを考えたのですが，みなさまの御意見は如何でしょうか？ その他，何か実験上のアドバイスなどもありましたら，何卒よろしくお願い致します。

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