mom-aさん
返事ありがとうございます。
1x〜10xで検量線を引いたときの増幅効率は80-120%「の間にある」のですね？低濃度側で直線性が寝てくるために直線性が悪くなる場合は直線性が得られる範囲までで検量線を引くことで問題ないと思います。ただ、原因が「低濃度での増幅効率が悪いため」かどうかはわかりません。サイクル数が多くなると（泳動してもはっきりしたバンドにはならないものの）ノンスペができてきたり、プライマーダイマーが出てきたりすることがあります。
なお、「信頼区間」という単語は別の意味を持つので、この場合は使わない方が良いような気がしますが、分析関係などでこういう使い方をするのでしょうか？
電気泳動をした結果では、ノンスペもプライマーダイマーもありませんでした。あと、信頼区間という使い方は、気になってましたが使ってしまいました。信頼区間という言葉は、私も使わないと思います。大変申し訳なく思います。
2点で31.09と31.82だから問題があるかどうか微妙な気もしますが、個人的にはサイバーグリーンで検出するときはCt値30以下で測定するようにしています。前述のように検量線の直線性が悪くなることがあるので。
わかりました。ありがとうございました。
＞スタンダードサンプルを1x, 2x, 4x, 8x, 16xで増幅させて、CT値を求めます。すると、それぞれ、CT値が23, 24, 25, 26, 27だとします。スタンダード以外のサンプルを1xで増幅させると、あるサンプルのCT値は28だとすると、このサンプルは検量線にのせることができないと思います。
この例ではCt値が23〜27までしか直線性が保証されていないわけですから、それ以上でもそれ以下でも「検出限界から外れているので測定不能」ということです。Ct値が28だろうが40だろうが、「>27」ということで処理するよりないのでは。
これを解決する方法として、私が考えたのは、@Total RNA量を多くしてcDNAを合成して、希釈系列を作ることA今まで45μg/μlを2μlとって（1x）リアルタイムPCRしていたところ（Total volume 20μlで，1x, 2x, 4x, 8x, 16xはそれぞれ、90, 45, 22.5, 11.25, 5.625ng）を8μlを入れて1xを作って、そこから4倍希釈で4点とって検量線を引き（1x, 4x, 16x, 64xはそれぞれ、360, 90, 22.5, 5.625ng）他のサンプルは、1xで増幅することを考えています（例えば，上の例でいくと1x, 4x, 16x, 64xでは，それぞれCT値が21, 23, 25, 27となり、あるサンプルは、CT値が26になります）。皆さん、どう思いますか？ |
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