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(無題) 削除/引用 No.2041-10 - 2008/10/02 (木) 20:17:21 - AP 自己フォロー >移動度は正常なプラスミドとほとんど同じで気づかないことが多いですが、わずかに異なります（大きめになるか小さめになるかは失念） 昔の実験ノートや、参考資料（キアゲンのトラブルシューティングなど）を見直したところ、移動度が大きくなる（見かけ上、分子量が小さめになる）が正解でした。

(無題) 削除/引用 No.2041-9 - 2008/10/01 (水) 15:11:26 - AP 切れないのはXhoIだけで、他の制限酵素では切れるのですか。 もしほかの制限酵素でも切れないばあい、プラスミド精製の時のアルカリ処理が過剰でプラスミドが変性している可能性があります。ニックの入っていないスーパーコイルのプラスミドはDNA鎖の自由度が低いので変性しにくいという性質を利用して、変性しやすいゲノムDNAと分離します。反面、変性が過剰でスーパーコイルが一旦解離してしまうと、自由度が低いので元の正常なラダーに戻らずプラスミドに歪みを生じいます。移動度は正常なプラスミドとほとんど同じで気づかないことが多いですが、わずかに異なります（大きめになるか小さめになるかは失念）。 こうなると、プラスミド全体、いかなる制限酵素でも切れなくなります（topoisomeraseでも使えば歪みを解くことが出来るかもしれませんが）。 正常なプラスミドが精製できていると思っても、精製の原理上、多かれ少なかれこうした歪んだプラスミドは混じっているものです（サブクローニングで空のベクターのコロニーを生じる主要な原因の一つ）。

切れにくいこともある 削除/引用 No.2041-7 - 2008/10/01 (水) 14:08:31 - あべちゃん 例えばXho1が消化しにくいと報告されている物。 http://www.promega.co.jp/jp/jp_tech/FAQs/Q&A_Reporter.htm#pGL2pGL3_01 pGL3ベクターのXho1は切断されにくいそうです。 でも、他の制限酵素などで先に消化し、スーパーコイルを解消してやると、問題なく切れるそうです。

(無題) 削除/引用 No.2041-6 - 2008/10/01 (水) 13:17:32 - おお XhoIの認識配列5'-C^T C G A G-3'があれば、大腸菌から精製してきても切れるはずです。ですから、配列が残っているなら酵素処理がワーク何らかの理由でワークしてない可能性がたかいです。DNAがきたないとか、DNA溶液にアルコールなどが混じっているとか、酵素が何らかの理由で失活してしまったものをたまたま使ってしまったとかなどの理由が大です。 XhoIは両方の末端についているのでしょうか?で1っぽうはきれてもう一方が切れないという状態ですか?ごくまれに、末端が削れて変になったままつながることがあります。きっと片一方のライケーションはうまくいっていって、プラスミドとインサートがリニアな状態でつながり大腸菌にはいり、中で適当につなげられてしまったような場合です。ですから、クローニングサイトの配列もシーケンスしたのであれば注意深く見てみる必要があるかもしれません。特にペクターから読むと近くて読みにくいところだと思いますが、、 XhoIの断片をほかのコンパチブルな制限酵素切断末端にライゲーションすることができますが、その場合はXhoI認識配列はできませんので切れません。これはすでにSalIで説明がありますね。 そのほかClaIとかXbaIはDam/Dcmメチレーションの影響を受けることがあります。詳しいことはこちらで確認してください。 www.neb.com/nebecomm/tech_reference/restriction_enzymes/dam_dcm_methylases_of_ecoli.asp

(無題) 削除/引用 No.2041-5 - 2008/10/01 (水) 13:09:17 - 奴隷頭 studentさんの仰るとおりsupercoiled plasmidは切れにくいとNEBのサイトにありますね。そういう経験が無いので知りませんでした。 Q1: Why isn't XhoI cutting? A1: 1. Blocked by CpG methylation. 2. Supercoiled plasmids may require up to 10-fold more XhoI for complete digestoin than linear DNA. http://www.neb.com/nebecomm/products/faqproductR0146.asp

(無題) 削除/引用 No.2041-4 - 2008/10/01 (水) 13:05:43 - 奴隷頭 シークエンスでXhoIサイトがきちんとしていることは確認できているのですか？ XhoIではなくて、例えばXbaIだとdamメチレーションで切れなくなることがありますよね。終止コドンUGAの直後にXbaIサイトを入れたデザインのPCRで後で切れなくなってしまうことをうちでは「XbaIの恐怖」と呼び慣わしています。

(無題) 削除/引用 No.2041-3 - 2008/10/01 (水) 13:05:24 - student SalIとXhoＩの相補性付着末端でなくとも、 ちゃんとした配列があってもXhoIなんかは立体構造的に前後の配列によって切りにくくなることがあると思います。

(無題) 削除/引用 No.2041-2 - 2008/10/01 (水) 12:47:35 - Pumpkin あります。 Xho1とSal1の様に付着末端が同じ配列だとライゲーションした後に、どちらの酵素でも消化できなくなることは明白だと思いますが、たまにベクターとインサートを同じ酵素で消化してライゲーションしても酵素サイトが潰れてしまって消化できなくなる場合があります（シーケンスできているので、プラスミドが低純度で消化できない可能性はないとして）。

制限酵素 削除/引用 No.2041-1 - 2008/10/01 (水) 12:37:55 - マり 　 　ＰＣＲ産物のときは切れた制限酵素がそのＰＣＲ産物を入れたベクターを形質転換し、サブクローニングし抽出したプラスミドだと切れなくなりました。シーケンスでそのＰＣＲ産物が入っていることも確認しました。制限酵素はxho1でhigh buffer 5時間以上はインキュベートしました。大腸菌（E.coli DH5α）でサブクローニングすると、特定の制限酵素で切れなくなることはあるのでしょうか。 　ご回答よろしくお願いします。

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