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(無題) 削除/引用 No.2040-13 - 2008/12/07 (日) 03:11:16 - そば 遺伝子のクローニングをする場合、ランダムプライマーよりもoligo dTやGSPを使った方が良い場合はありますよ。特に長鎖をクローニングしたいときなど、そういう現象に当たることがあります。 >合理的な理由付けはありません。 一本のmRNA上に2ヵ所（あるいはそれ以上）ランダムプライマーが結合した場合、複数ヶ所から逆転写が開始されますが、mRNAの3'側から合成されたcDNAが5'側のプライマーの結合部位まで届いた時、どうなるのでしょうか？ 少なくともAMVには5>3エキソヌクレアーゼ活性はありませんし、リン酸化もしなければライゲーションもしませんよね？ （MMLVにもそのような活性は無かったと思いますが・・・。失念） それが合理的な理由になるんじゃないでしょうか。

RNAの酸化電位と溶液中の相互作用に 削除/引用 No.2040-12 - 2008/12/04 (木) 18:46:12 - マイ

(無題) 削除/引用 No.2040-11 - 2008/10/02 (木) 10:24:47 - AP >[Re:9] Rさんは書きました : > cDNA cloningが目的の場合、random primerでは全体の収量はよくても完全長の割合はすくないのではないですか？ > cDNA cloningの時はdT or specific primerの方がよいと思っていました。 答えは、 「どういうプライミングをするかは、単に効率だけではなく、目的や実験デザインによっても使い分けられるべきですが。」 につきるのですが、 oligo dTでプライミングすれば完全長がとれるというのは、特別な方法を使わない限り滅多になく、5' endに届かないことが多いし、内部の二次構造のためにどうしても3'に近いところで止まってしまう鋳型もあります。全体として、3'側にバイアスのかかったcDNA poolになってしまいます。cDNAがとれたとしても、walkingや5' RACEをしなければ「完全長」は無理なことがほとんどです。 oligo dT primed cDNA library/poolだと、手にしているプローブや、プライマーが5'末端側しかない場合、cDNAの取得が困難である可能性がかなりあります。 random primedならcDNAのcoverageにバイアスがかかりにくいので、そういう心配が少なくなります。いったんcDNAがとれたら同じ library/poolからwalking/RACEで全長をカバーできます。 cDNA libraryを作るときも、oilgo dTと同じくらいrandomが使われますし、時にはそれぞれでprimingしたcDNAを混ぜて作ることもあります。

(無題) 削除/引用 No.2040-9 - 2008/10/02 (木) 09:33:52 - R cDNA cloningに関して >random primerが一番良いはずなので、それでだめなときにgene specific primerならうまくいくという合理的な理由付けはありません。 cDNA cloningが目的の場合、random primerでは全体の収量はよくても完全長の割合はすくないのではないですか？ cDNA cloningの時はdT or specific primerの方がよいと思っていました。

(無題) 削除/引用 No.2040-8 - 2008/10/01 (水) 23:16:41 - AP >windowさん >cDNAクローニングを目的として、 ランダムプライマーやpolyAプライマーのRT-PCRでは全くバンドが得られないときに、 >その遺伝子特異的なプライマーでRT-PCRを行えば実際にクローニングできたということはあるものなのでしょうか？ 可能性はあると思います。 しかし、一般的にRT-PCRの収量は random primer > gene specific primer >= oligo dT primer と言われています。 random primerが一番良いはずなので、それでだめなときにgene specific primerならうまくいくという合理的な理由付けはありません。 RT-PCRでネックになるのは逆転写で、ここでRNAの鋳型からいかに効率よくcDNAを合成するかが結果に大きく影響するし、サンプル間でも大きく振れる可能性のあるところです。RTaseのprocessivityがあまり強くないので、RNAの精製度などに影響を受けやすいということもあると思いますが、RNAが二次構造を取りやすく、そこで伸長が止まってしまうというのが大きいです。 その点、random primerは鋳型RNAのあちこちにアニールして同時多発的に伸長されるので、二次構造を取りにくくするでしょうし、二次構造があってもその先のプライマーからも伸長が起こるので、逆転写の効率が高くなります。 昔、何かのキットのマニュアルかなにかで読んだところによると、インプットのpoly A RNAに対する逆転写効率はoligo dTで良くて15-20%（精製度によってはもっと落ちるとも）、randomだと50%以上というようなことが書いてあったと記憶します。 もちろん、どういうプライミングをするかは、単に効率だけではなく、目的や実験デザインによっても使い分けられるべきですが。

(無題) 削除/引用 No.2040-7 - 2008/10/01 (水) 23:11:08 - window ・。 > > リアルタイムを行うときのプライマーが、mRNA由来のcDNAだけを検出できるということなのでしょうか？ > このあたりの分子生物学的な素養が不十分で、混乱しております。宜しくお願い致します。 > おそらくランダムプライマーとＰＣＲに使用するプライマーを同じだと思っているのではないでしょうか？ ＰＣＲに使用するプライマーは２０ｂｐ以上あり目的の遺伝子に特異的であることが前提です。 一方ランダムプライマーは６ｂｐぐらいのしかも様々な配列のmixになっているので基本的にすべての遺伝子に相補的であります。 だからリアルタイムＰＣＲに用いるプライマーはご質問の通り目的のcDNAだけを検出するものです。

(無題) 削除/引用 No.2040-6 - 2008/10/01 (水) 22:35:39 - AP PCRを根本的に良く理解していないから勘違いしているようです。 PCRは配列特異的なプライマーを使って、ねらったDNA配列を増幅します。 これを使えば、いろいろな配列を含んだ全ゲノムのDNAからでも特定の領域だけを増幅でき、それ以外の部分は増えないので、ねらった領域だけが検出・取得できるのです。 RT-PCRでも、すべてのRNAを逆転写したcDNAの混合物の中から特定の配列をもつものだけをPCRで増やして検出するのです。 >mRNAの発現量を見ているとは言い難いのではないかと思うのですが、 全mRNAの量を測ろうとしているのではなく、興味の遺伝子の転写産物を測って、その遺伝子の発現量を調べるのです。

さらに質問なのですが 削除/引用 No.2040-5 - 2008/10/01 (水) 22:02:05 - 初心者 あべちゃんさん、おおさん、分かりやすい説明をありがとうございます。 すみません、まだ疑問が残っているので教えて下さい。 ランダムな配列のプライマーが、相補するRNAを認識して、逆転写反応が進んだ結果できるcDNAの構造は、どのRNA（mRNA, tRNA, rRNA)が鋳型であっても変わりないのでしょうか？　そうだとしたら、ますますリアルタイムRT-PCRで“mRNAの”発現量を見ているとは言い難く、全RNAの混合物の発現量を見ているということにはならないのでしょうか？トータルRNA中の　各RNAの存在比率を考えると、ランダムプライマーに貼り付かれる確率はmRNAがいちばん低いように思ったのですが・・・。 リアルタイムを行うときのプライマーが、mRNA由来のcDNAだけを検出できるということなのでしょうか？ このあたりの分子生物学的な素養が不十分で、混乱しております。宜しくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.2040-4 - 2008/10/01 (水) 16:49:43 - window 便乗質問させていただきます。 ランダムプライマーやpolyAプライマーでRT-PCRを行うよりも目的の遺伝子特異的なプライマーのみでRT-PCRをすると、コピー数的には目的遺伝子のプライマーだけで行ったほうが酵素の効率などを考えてコピー数は多くなると思います。 そうであれば cDNAクローニングを目的として、 ランダムプライマーやpolyAプライマーのRT-PCRでは全くバンドが得られないときに、 その遺伝子特異的なプライマーでRT-PCRを行えば実際にクローニングできたということはあるものなのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2040-3 - 2008/10/01 (水) 14:43:54 - おお >[Re:1] 初心者さんは書きました : > そのように調整されたcDNAを使ってリアルタイムRT-PCRをしても、mRNA由来のcDNA量が少なくて、mRNAの発現量を見ているとは言い難いのではないかと思うのですが、それは構わないのでしょうか？　 mRNAが微量であっても、cDNAができて、そこからPCRをするわけですから、理論的には問題がないとされてると思います。 たとえば1ugのトータルRNAにあなたのターゲットが1pgあったとします。これがランダムオリゴマーでcDNAができるわけです。 同時に同じサンプルを使って、1ugのトータルRNAからポリAのついたRNAを精製して全量をcDNAにしても、あなたのターゲットは1pgでそれからcDNAができるわけです(理論的にですが)。違うサンプルが1ug中20pgあればどうなりますか?量におおじてcDNAができると思いませんか? そのばあい、トータルRNAとポリA精製したRNAでなにか違いがありますか? たしかにランダムプライマーでRTする時にプライマー量とRNAの比が変わってくるとcDNAの出来具合が変わってくるので、そこは気をつけないと行けないと思います。 >実験本で勉強を始めたばかりで、トータルRNAを鋳型にランダムプライマーで逆転写反応をしたときにチューブ内でどういう事が起こっているのかまだきちんと理解できていないのかもしれないのですが・・・。 すべてのRNAのランダムな位置にプライマーがついて、そこからRTがはじまる(伸長する)といえばイメージできるでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.2040-2 - 2008/10/01 (水) 14:26:00 - あべちゃん > トータルRNAを鋳型にランダムプライマーで逆転写反応をかけると、トータルRNAにはmRNA　tRNA　rRNAが含まれているので、mRNA以外のRNAからもcDNAが作られますよね？　 はい。 > そのように調整されたcDNAを使ってリアルタイムRT-PCRをしても、mRNA由来のcDNA量が少なくて、mRNAの発現量を見ているとは言い難いのではないかと思うのですが、それは構わないのでしょうか？　 確かに量比は少なくなりますが、PCRで増幅できるのであれば問題ないと思います。 しかし、逆にヒストンはポリAを持たず、lower eukaryoteのポリAは短い事もあるので、オリゴdTプライマーで逆転写した場合に、検出できないこともあります。 さらには、長いmRNAをオリゴdTプライマーで逆転写し、5'側のmRNA配列をもとに設計したプライマーセットでPCRしようとしても、逆転写反応が5'側まで十分に伸長していなかった場合も、検出しずらい結果になり得ます。 反応中でどういったことが起きているかについてですが、 ランダムプライマーを用いて逆転写する時、文字通り6merや9merなどのランダムな配列のプライマーが、たまたま相補するRNA (r, t, mなど)を認識して、逆転写反応が進みます。一方、オリゴdTプライマーの場合、ポリAテールを持つmRNAのポリA部分に相補して、逆転写反応が進みます。自分で設計した特異的な配列のプライマーを用いることもあります。

トータルRNAを鋳型にランダムプライマーで逆転写したら 削除/引用 No.2040-1 - 2008/10/01 (水) 12:10:42 - 初心者 初歩的な質問ですが、宜しくお願い致します。 ランダムプライマーは、rRNA、mRNA、tRNA等全てのRNAの逆転写反応に使用可能である、と書かれています。 トータルRNAを鋳型にランダムプライマーで逆転写反応をかけると、トータルRNAにはmRNA　tRNA　rRNAが含まれているので、mRNA以外のRNAからもcDNAが作られますよね？　 そのように調整されたcDNAを使ってリアルタイムRT-PCRをしても、mRNA由来のcDNA量が少なくて、mRNAの発現量を見ているとは言い難いのではないかと思うのですが、それは構わないのでしょうか？　実験本で勉強を始めたばかりで、トータルRNAを鋳型にランダムプライマーで逆転写反応をしたときにチューブ内でどういう事が起こっているのかまだきちんと理解できていないのかもしれないのですが・・・。

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