はじめまして。いつもお世話になっています。
今in situ用のプローブ作成のためにクローニングを行おうとしているのですが、
トランスフォームをしていざプレートにまいてみるとまったく生えてきません。
PCRのテンプレートにはcDNAを用いています。
プライマーに制限酵素サイト(EcoRI、XbaI)を組み込んで、
PCR産物をカラム精製後、制限酵素で処理(2種同時に入れてます。BufferはTOYOBOのMを使用)し、ゲルでえいどうして切り出した後に、同様に制限酵素処理したpBlue Script SK+にライゲーションさせています。
ライゲーションはT4リガーゼを使って30マイクロリットルの系で反応させています。
コンピテントセルはDH5αを使っています。100マイクロにライゲーションミックスを10マイクロ入れてトランスフォームさせ、全量をLB＋アンピシリンプレートにまいています。コロニーの判別にはIPTGとX-galを使って青白で判定してます。
コンピ自体も不調で、作り直して効率が4×10の7乗程度と良くはないのですが、それにしてもまったく生えない(セルフライゲーションもない)ですし、もうすでに3回ほどプライマーの配列チェックからやり直しているのですがまったく改善されず、途方にくれています。
どこを改善すればよいか、あるいは些細な点でもかまいませんのでご指摘をよろしくお願いいたします。 |
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