BioTechnicalフォーラム [クローニングでつまづいてます]

遅ればせながら…

No.2030-23 - 2008/10/09 (木) 03:48:11 - transplant

おおさん、ＡＰさん
詳しい解説付きの情報ありがとうございます。
Molecular cowding reagentの説明は非常にとらえやすかったです。

まるさん
やはりベクター変えるとかブラントライゲーションやってみるとかしたほうがいいかもしれません。

ひとつだけ、まさかとは思いますが。
以前、まるさんとまったく同じ方法でクローニングし、今回のようなトラブルに遭ったことがあります。

その時の原因はノンスぺを切り出してたんですね。
薄いゲルで流した時はほとんど同じ位置にノンスぺがあったんです。（しかも目的物よりも多）切り出しじゃない濃いゲルで流した時に気がついたんですが。
確率的には限りなくないことなんでしょうが、一度濃いゲル（短フラグメントならアクリルアミドゲルとか）できっちり大きさを確認するか、シークエンスしてみてもいいかもしれません。

(無題)

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No.2030-22 - 2008/10/05 (日) 04:19:05 - おお

入ってもよさそうなんですがね。
PCRの末端は不完全なこともあるのでクレノーを念のためかけてみるとか、思い切ってSma1サイトなどを使ってブラントでライゲーションしてみるとか?
ブラントのときは念のためクレノーをかけて、そのままライゲーションしてSma1(ベクターを切った制限酵素)できるか(この時インサートにその制限酵素認識配列がないことがぜんてい)、ベクターのを脱燐酸かして、PCRプロダクトを燐酸化する、あるいはプライマーを燐酸かしてPCRをかける。
後たまたま悲惨な目にあった人がいたので紹介すると、あるベクターをもらってそのベクターを増やすために大腸菌にいれてコロニーを拾ってプラスミドをえ、制限酵素でチェックして、目的のベクターを得たわけですが、それを使いお示しのようなシンプルなサブクローニングをすると、すべてワークしているはずなのにうまく行かず、その人はそういう経験が浅いためにさんざん疑われていたのですが、
オリジナルのチューブからベクターをとって同様にするといとも簡単に入ったコロニーができたということがありました。
ベクターとの相性もかんがえて、pBlue Script SK+からSK-とかKSとかに変えてみるとかプロメガのpGEMを使ってみるとかいうのもてかもしれません。
わたしは、サブクローニングで、酵素その他がワークしているにもかかわらず、うまく行かない時は、同じことはあまり繰り返さず、違う方法をどんどん試していきます。ですからデザインする時に複数のアプローチがとれるように意識しています。
PCRプロダクトをなにか内部で切れる酵素で切ったりして、目的のものが増幅されているか確認してみる必要もあるかもしれません(シーケンスでも良いですが)。そういう意味でプラントだと何が増えていても取りあえず入るだろうという考えもありました。

何か参考になることがあればさいわいです。

(無題)

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No.2030-21 - 2008/10/05 (日) 01:35:07 - まる

皆様さまざまなご指摘ありがとうございます。

皆様にご指摘いただいたとおり、インタクトのBSK+をトランスフォームしたところきちんと生えたのでコンピの状態は悪くないことが確認できました。
同時に、EcoRIでワンカット入れてそのまま(インサートを入れずに)ライゲーションしたものもトランスフォームしてみました。こちらもしっかり生えたのでライゲーションもうまくいってそうです。
これで問題はライゲーション以前にあることがわかりました。

ですが、教えていただいたとおりにDNA切り出しの時に紫外線を当てないように、2レーンに流して片方を指標にもう片方には下にアルミホイルを敷いて紫外線を遮断して切り出したのですが、やはりコロニーがはえませんでした。

ゲル切り出しの後もきちんと電気泳動で回収できたことを確認しています。

これはプライマーの設定からすでに問題があったと考えるべきなのでしょうか？

制限酵素の活性の問題かもしれませんが・・・・

(無題)

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No.2030-20 - 2008/10/03 (金) 12:03:15 - AP

>[Re:18] transplantさんは書きました :
> ライゲーションの際にPEG入ると効率上がるんですか？
> ライゲーション添加剤ってあんまり聞かないですけど、PEG以外にどんなんがあるんでしょうか？

TAKARAのligation kitにも入っていたはずです。昔のカタログには、PEGの効果をデモンストレートする実験例（PEGプラス適切な濃度のNaClの添加で効果が高い、というような）が出ていたと思いますが、今は載ってなかったかもしれません。PromegaのRapid ligation systemにも入っていたと思います。RocheのRapid ligation sytemも（組成を公表していないようなんですが）説明書の参考文献を読むと、たぶんPRGを入れています。
Molecular Clonigにも、blunt-end ligationのプロトコールに採用されているほか、information panelで言及されています。

ligationを促進する添加物についてはいろいろ報告があります。そのなかでも、PEG800はもっとも効果があり、実際に広く使われていると思います。intermolecular ligationだと3桁くらい促進されるそうです。関係する文献はGoogle Scholarで「ligation PEG」で検索でもすればたくさん出てきます。

ligationはDNA末端の濃度が高いほど起こりやすいですが、PEGはMolecular cowding reagentとして作用し（反応系の一部を、反応には参加しない高分子で占めさせて隙間を少なくするというようなイメージでしょうか？）、実質的な濃度を上昇させます。cowding reagentはligationだけでなく、hybridizationを促進させるのに使われますし、T4 Kinaseの交換反応を促進したりもするそうです。
（review）http://arjournals.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.bb.22.060193.000331

ligationを促進する添加物としては、ほかにMolecular Cloningではcondensing reagent（水和によって自由な水分子を奪うと言うことでしょうか？）として作用する、Hexamminecobaltcobalt chlorideが言及されています。

過去にはT4 RNA ligaseを添加するとT4 DNA ligaseのligationが促進されるという報告もあったようですが、今では信じられていないようです。

昔は、ligation反応にはスペルミジンが加えられることが多かったですが、今はほとんどやらないですね。

(無題)

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No.2030-19 - 2008/10/03 (金) 09:52:58 - おお

>[Re:18] transplantさんは書きました :
> ライゲーションの際にPEG入ると効率上がるんですか？
> ライゲーション添加剤ってあんまり聞かないですけど、PEG以外にどんなんがあるんでしょうか？

http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/t4dnaligase_5U_man.pdf

添付の物をそのまま使ってますので、あまり細かいことは何かで読んだようなきがしますが、よくわかりません。
ただし、ファージのような直鎖のものをえたい場合PEGの配合をいじったりしてという話は聞いたことがあるような気がします。
その他の添加物はよく分かりません。PEGに類似したPVAとか使うかもしれませんが、、、、

> 僕はNEBのふつーのライゲース使ってるんですが、１０×ATP配合バッファーのATP活性があんまり信じられないのでいつもちょびっとだけATPを余分に加えてライゲーションします。問題ないはずです、たぶん。

私もATPだけは、余分に追加しています。古いライゲースを古いバファーでやるとだめで、新しいバッファーだとワークしたということがありましたので。おそらくATPが弱ってたのだろうと想像しています。

PEGですか

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No.2030-18 - 2008/10/03 (金) 00:43:58 - transplant

ライゲーションの際にPEG入ると効率上がるんですか？
（PEGって、ポリメラーゼや制限酵素でも入ってるので酵素にやさしいとは思うんですが）

僕はNEBのふつーのライゲース使ってるんですが、１０×ATP配合バッファーのATP活性があんまり信じられないのでいつもちょびっとだけATPを余分に加えてライゲーションします。問題ないはずです、たぶん。

ライゲーション添加剤ってあんまり聞かないですけど、PEG以外にどんなんがあるんでしょうか？

(無題)

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No.2030-17 - 2008/09/30 (火) 15:29:58 - おお

>[Re:16] motooさんは書きました :
> コンピテントセルは、10の7乗あれば,ほぼ問題ないと思います(サイズにも依存するかもしれませんが)。

私もそう思います。ストックが悪くなっているかどうかは、インタクトのプラスミドでポジコンを取ればいいかと思います。そういう意味でコントロールを取りながらと前に書きました。同様にライゲーションはシングルカットいれたプラスミドライゲーション(-と+)の比較など、次の実験の時にとれるコントロールは同時にでもやっておくと良いと思います

> また、ライゲーション時のインサートとベクターの比率は、クローニングにおいて、意外に大変重要です。1:3でダメだったら、1:2～1:5くらいまで試されては、いかがでしょうか？

1:3で全然取れないのが、1:5でうまく行くと言うのはあまり現実味がないですね。1:3で100個に一個のクローンができていてスクリーニングでひっかからなかったのが1:5で40個に一個ぐらいの割合になってたまたま20個拾ったら運よく1個見つけられたというぐらいなら有り得るかもしれませんが、、、

逆にちゃんとワークする系でインサートを10-100倍ぐらい加えると言うのはやります。そうするとトランスフォーメーションの効率がある所でガクッとおちます。そういうプレートから拾うとポジティブの割合が高いからスクリーニングしやすいわけです。ただし、まれですがタンデムにインサートが2つ挿入されたものに出くわすことがあります。制限酵素で確認するとき区別できるように注意しないといけません。今回はそれ以前に解決しないといけないことがありそうです。

> ライゲーションは、Ligation High(TOYOBO)が良い仕事をしてくれてます。
> 経験から、ひと言述べさせて頂きました。

私は個人的にGIBCO(インビトロジェン)が好きです。たぶんPEGがはいっているとおもう。

(無題)

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No.2030-16 - 2008/09/30 (火) 14:16:30 - motoo

コンピテントセルは、10の7乗あれば,ほぼ問題ないと思います(サイズにも依存するかもしれませんが)。以前クローニングでトラブった際の解決策(?)として。
PCRプライマーが古く凍結融解が多く、ストックプライマーの配列が削れていた疑いがありました。制限酵素配列にGAGAを付加していましたが、さらに配列を付加したところ、改善されました。
また、ライゲーション時のインサートとベクターの比率は、クローニングにおいて、意外に大変重要です。1:3でダメだったら、1:2～1:5くらいまで試されては、いかがでしょうか？
ライゲーションは、Ligation High(TOYOBO)が良い仕事をしてくれてます。
経験から、ひと言述べさせて頂きました。

(無題)

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No.2030-15 - 2008/09/30 (火) 13:44:36 - おお

>[Re:11] まるさんは書きました :

> BSKを3ulライゲーションに使い、それと等量かやや多くなるようにインサートの量を決定
>
> という流れになります。10分の1量ですのでロスがなかったとして50ng/反応ということになります。

念のためですが、ゲルから回収後、電気えいどうとかで、回収できていることを確認していますか?
たまにうまく回収できなくなったとか騒ぐ人がいます。

(無題)

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No.2030-14 - 2008/09/30 (火) 13:35:26 - AP

UVの悪影響と対策については、過去に何度も取り上げられているので、検索して探してみてください。古い方のBio Technical フォーラムも見てください。
要は遮蔽するか、ゲルを切り分けて、切り出すバンドのごく一部だけか、隣に流した位置決め用のレーンだけにUVをあてて観察すればよいです。

>ですがその後僕と同じようにクローニングしようとした先生はうまく行っていませんでした。

polymeraseはなにを使っていますか。校正活性のある酵素ではblunt endになるので適していません。また、PCR反応後そのまま、冷蔵、室温などで放置すると、おそらく末端が削れるために、クローニング効率が悪くなると言うことも以前のトピで指摘されていました。

>プライマーに制限酵素サイト(EcoRI、XbaI)を組み込んで、
PCR産物をカラム精製後、制限酵素で処理(2種同時に入れてます。BufferはTOYOBOのMを使用)し

最近、別のトピにも書きましたが、同時二重消化のために至適でないバッファーと酵素の組み合わせを使用するのは、手を抜くためだけの簡便法でトラブルが多いです。各メーカーのガイドも食い違いが多く、あんまり信頼できない組み合わせも多いです。消化パターンのチェックくらいなら良いかもしれませんが、クローニング目的には使わない方が良いと思いますよ。

たとえば、XbaIとEcoRIの組み合わせは、メーカーによってMでやれというところもHでやれというところも、同時消化せず順次消化でやるべきといいうところもあります。また、至適でない条件になる場合は、酵素量を何倍入れろとか、反応時間を延ばせとか言っていて、時間やコストの節約にならないです。

私なら、XboI, Mで1時間ほど切ったあと（慎重を期すときは一旦電気泳動で完全消化を確認してから）、10xHと水を加えて、塩濃度がHに、体積が1.5～2倍になるようにしてEcoRIで消化します。
クローニング目的ではなく、プラスミドのスクリーニングなど消化パターンを見るだけなら、同時消化をしないこともないと思いますが、そのときはHにするか、MとHの中間にします。至適塩濃度の高い酵素を低いバッファーで切ると、非常にstar活性が出やすくなるからです。star活性を体験してみたいならば、EcoRIをMやLで使ってみればかなり確実に起こすことができますよ。

(無題)

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No.2030-12 - 2008/09/30 (火) 13:25:20 - ~

>UVを当てない場合は制限酵素できらないということでしょうか？
私のところでやっていたのは、制限酵素処理後、幅の広いウェルで電気泳動
泳動後にウェルの端＋λHindIIIの部分を切りとってそこだけEtBrにつける
それでサイズと位置を確認したら、残りのゲルとくっつけて切り出すというやり方でした。

今回トラブルが起きているのは、まるさんだけでなく、
別に操作をしている先輩でもトラブルが起きているのでしたら、
共通の試薬等のトラブルなのかもしれません。
制限酵素は切れていて、Tベクターは専用のライゲースを使っているでしょうから、
ライゲーション以降に原因があると予想されます。
共通で使っているのは、コンピとプレートくらいでしょうか？

>私の先生もトランスフォーメーション以後を疑っていて、
コンピが問題だと考えているのでしたら、
>制限酵素サイトを入れてのクローニングは2ヶ月前にもプローブ作成に使ったので
このときに使ったフラグメントをもう一度ライゲーションさせて、
並べてトランスフォーメーションしてみてはいかがでしょうか。
ライゲーション以降のチェックになります。

また、そのロットのコンピを作ったときに、適当なプラスミドで形質転換効率を調べていますよね。
残っているチューブでもう一度測りなおすことで、コンピの劣化の確認が出来るでしょう。

それにより、ライゲーションなのか、トランスフォーメーション以降なのかの原因が切り分けられると思います。

その実験をする際には、LBプレートは作り直した方がいいかと思います。
誰かが間違えて10倍量のアンピシリンを入れて作ったり、
カナマイシンを入れて作ってしまったのかもしれません。

(無題)

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No.2030-11 - 2008/09/30 (火) 13:01:55 - まる

すばやいお返事ありがとうございます。

DNA量について言い足りない部分がありました。
正しくは、

500ngを制限酵素処理
　　↓
全量を電気泳動　→　ここでインサートのほうも全量を電気泳動しバンドを比較
　　↓
ゲルを切り出して精製、カラムを通して30ulの滅菌水に溶出
　　↓
BSKを3ulライゲーションに使い、それと等量かやや多くなるようにインサートの量を決定

という流れになります。10分の1量ですのでロスがなかったとして50ng/反応ということになります。

私の先生もトランスフォーメーション以後を疑っていて、現在コンピテントセルをまた作り直しているところです。
実験後1度作り直したのですが効率がよくなかったので大元の株がいけないのかも知れないということで現在は別のコンピを作っているところです。

(無題)

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No.2030-10 - 2008/09/30 (火) 12:53:23 - おお

>[Re:9] まるさんは書きました :

> UVを当てない場合は制限酵素できらないということでしょうか？
> 制限酵素は別の実験で両方とも活性は確認していますし、プライマーの制限酵素サイトには外側にGAGAと足していますので酵素の問題ではないと考えています。

電気えいどう後2レーン流して1レーンをアルミホイルで覆った状態で、もう１レーンのバンドをEtBr/UVで検出してそのバンドを参照してUVをあててないレーンから切り出すとか、メチレンブルーなどでせんしょくするとか、皆さん工夫しているようです。

>
> 僕の実験の後に先輩がTAクローニングをしたところ効率は悪いものの生えては来たそうです。
> ですがその後僕と同じようにクローニングしようとした先生はうまく行っていませんでした。

>
> DNAの量ですがpBSK+を500ngを制限酵素で切り、それを電気泳動したバンドの濃さを参考にDNAがBSKと等量かあるいはやや多くなるようにしてライゲーションミックスを作っています。

500ngをライゲーションして全部をトランスフォーメーションですか?それなら多すぎるくらいだと思いますよ、、、何でバックグランドもでないのか不思議です。50ngくらいしか使わないですね一般的なプロトコールだと。私は電気えいどうで辛うじて見れるぐらいでやってますので10ngいかです。

全体的にみて、何かシステムがうまくいってませんね。とくにトランスフォーメーションか、それいこうがおかしいかも。それ以外に原因があるかもしれませんが、、、
プレートを作ったフラスコとかがきれいに洗えてなくって洗剤が落ち切ってなかったとか、、、
知らない間にコンピをストックしているディープフリーザーの温度が一時的に上昇して、コンピが悪くなっているとか、、
いろんな物に対してコントロールを置きながら進めると、原因が絞れてくると思います。

(無題)

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No.2030-9 - 2008/09/30 (火) 12:09:57 - まる

皆様多数のご指摘ありがとうございます。

UVを当てない場合は制限酵素できらないということでしょうか？
制限酵素は別の実験で両方とも活性は確認していますし、プライマーの制限酵素サイトには外側にGAGAと足していますので酵素の問題ではないと考えています。

僕の実験の後に先輩がTAクローニングをしたところ効率は悪いものの生えては来たそうです。
ですがその後僕と同じようにクローニングしようとした先生はうまく行っていませんでした。

DNAの量ですがpBSK+を500ngを制限酵素で切り、それを電気泳動したバンドの濃さを参考にDNAがBSKと等量かあるいはやや多くなるようにしてライゲーションミックスを作っています。

この後TAクローニングを試してみるつもりですが、制限酵素サイトを入れてのクローニングは2ヶ月前にもプローブ作成に使ったので(そのときはうまく行きin situもデータが出ました)原因が気になるところです・・・

(無題)

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No.2030-6 - 2008/09/29 (月) 20:22:40 - ~

まずは、行った操作が適切であることが確認できません。

とりあえず、ライゲーションにまわすDNAには、
一切UVを当てずに操作しましょう。

Tベクターに入れてみれば制限酵素やプライマーの問題は解決できるでしょう。
(制限酵素認識サイトの外側に、余分な配列は忘れていませんよね)

その際には、同期や先輩がPCRで増やしたTベクターにいれた実績のあるフラグメントをちょっと貰って、
同時にライゲーションしましょう。

それで、あなたの増やしたフラグメントだけがコロニーが出てこないのであれば、
操作の問題ではなく、配列など次の問題を探す段階になるでしょう。