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(無題) 削除/引用 No.203-5 - 2007/10/01 (月) 22:18:38 - 院生 もううまくいったでしょうか？ ご存知かもしれませんが、スフェロプラスト化する際の大腸菌のODもかなり重要でした。 OD660nmが0.6ぐらいのときが良かったですよ。

(無題) 削除/引用 No.203-4 - 2007/09/24 (月) 11:05:10 - 院生 こんにちは。 私も現在、硫酸還元菌のスフェロプラスト化を行っているのですが、スフェロプラスト化効率が悪く困っております。 練習で大腸菌のスフェロプラスト化を行ったとき、9割程度の菌がスフェロプラスト化されたので、その方法を紹介します。 Miura T, Mizushima S.の方法です。 菌（対数増殖期中期）を回収後、冷水にけんだく。 氷上で攪拌しながら、2M sucroseと0.1M Tris-HCl（pH8.3）をゆっくり添加。 その後同様に0.5%Lysozyme、1%EDTA（pH7）を添加。 40度の温水中で2分反応後、30度で一時間反応させる。 温度を上げるときは一気に上げるのがポイントみたいです。 ちなみにりぞチームはシグマの卵白りぞチームを使っています。

(無題) 削除/引用 No.203-2 - 2007/09/18 (火) 21:02:00 - ats うろ覚えで申し訳ないですが、卵白Lysozymeは弱アルカリで活性が高かったと思います。 粉末ではなくLysozyme溶液を加えているとして、Trisは低温でpHがやや下がりますので、pH8.6ほどのものを使うと良いかもしれません。 また、室温で５分反応後、氷上で３０分冷やすのはいかがでしょうか。 使用したことはありませんが、MERCK社で250倍も活性の高いrLysozymeを販売しています。

大腸菌のスフェロプラストがうまく作れません 削除/引用 No.203-1 - 2007/09/15 (土) 18:58:15 - 学生３年目 はじめまして。 いつも拝見して勉強させて頂いております。 今私は、大腸菌のある膜酵素が本当に膜に局在しているか否かを調べるため、 膜成分の分画実験を行っています。 方法は、Itoらの方法（1977）に則って、 集菌 ↓ 20% sucrose, 30 mM Tris-HCl (pH 8.1)存在下で Lysozyme (終濃度　0.1 mg/ml)とEDTA (終濃度　0.01M, pH7.5)を加え、氷上30分 スフェロプラストを形成 ↓ 低速遠心にてペリプラズム画分とスフェロプラスト画分を分離 ↓ sonicで菌破砕 ↓ 低速遠心にて未処理の菌体と細胞粗抽出液を分離 ↓ 細胞粗抽出液を15％と70％の不連続ショ糖濃度勾配にかけ、 超遠心によって膜画分を分画 という手順で行っています。 この手順の最初の方、スフェロプラストの調製がうまく行きません。 顕微鏡で経時観察を行いながら反応させているのですが、 30分経過しても2割程度の細胞しかスフェロプラストになっていないようです。 さらに、検鏡中にスフェロプラストが破裂する光景もしばしば見られます。 どなたか、効率よいスフェロプラストの調製のコツをご存知の方がいらっしゃいましたら、 是非ご教授ください。

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