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(無題) 削除/引用 No.2029-15 - 2008/10/03 (金) 06:07:16 - おお http://www.sigmaaldrich.com/sigma/product%20information%20sheet/t8787pis.pdf 実際は275と283nmに吸収ピークがあるようです。260はそのピークのすそに当たりますが、どれくらいの吸収が残っているか分かりません。さらに、溶液の状態で幾らかシフトするかも分かりませんので、なんともいえないのですが、そのような物が混在した状態で、正確に吸収(260と280の比など)をとらえていないだろうと思えます。 核酸は蛍光を使って、蛍光強度を測る手があります。DAPIやヘキストなどは特にダブルストランドであればつかえますし、一本鎖のRNAやDNAであれば、ほかの色素を使わないと行けないかもしれません。あとは、脱燐酸かをしておいて、PNKと32PgammaATPでラベルするとかでしょうか、、、そのた、モノマーに分解して、クロマトなどというのも方法論としてはあるのかと思います。 ただ淡泊についている核酸を実際に見た経験があるわけでありませんので、経験者のコメントがあった方がいいかなと思います。

(無題) 削除/引用 No.2029-14 - 2008/10/02 (木) 20:49:45 - きりん qqさん、Aさん、おおさん教えていただいてありがとうございます。 　Tritonの存在は見落としていました。260 nm付近に吸収があるのですね。 核酸の存在を検討する前にまずTritonを除くか、qqさんの勧めてくださったC12E9に替えるか して吸光度の変化を見てみます。 　それでもまだ260 nmの吸収が強いようであれば、ベンゾネースや陰イオン交換カラムを 購入しようと思います。 　おおさんが仰ってくださったように核酸混入の有無を明確に立証できる方法があれば 一番いいですね。自力ではちょっと考えつきませんので、アドバイスいただければ幸いです。 　また私も実験して原因がわかりましたら、報告させてもらいます。 とても有用なアドバイスを皆さんからいただき、本当にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2029-13 - 2008/09/30 (火) 09:15:52 - qq 言ったてまえ、 仮にtritonだとすると、tritonの代わりにフェニル基のないC12E9（polyoxyethylene laurylether）に変えるとか、GSHで溶出する前にbufferをtritonから他のdetergent（もしくはdetergentを除去）に変えることが可能かもしれません。 もう一つは、A280/A260を考慮しないで、適切なタンパク定量法でタンパク質を定量し、SDS-PAGEのバンド強度と比較して、納得することでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2029-11 - 2008/09/30 (火) 01:14:12 - おお 核酸が交じっている可能性はありますね。でもワンステップなので何かほかのものも交じっている可能性はあるかもしれません。 TRITONを使っているのでちょっとUVの吸収は疑問が残ります。核酸の結合を見るのにこの様な局面で皆さんどうさせているのでしょうね。 そういうレスがつけばいいのですが、、、、 TRIONは非常に大きな見せるを低濃度でも作りますので、透析で可也残っていると思います。タンパクによってはTRITONがくっついたままということもありますし。

(無題) 削除/引用 No.2029-10 - 2008/09/30 (火) 00:57:01 - A 理論的にはA280での吸光を計ることによって精製タンパク質の 濃度を計る事はできます。これはTyr、Trp、PheそれにSS結合の の数に依存して計算された値を用います。イプシロンといわれる 値で今手元にありませんがネットで調べれば出てくるかと思います。 ただし実際にはあまり正確に測れないので私の場合はたとえば 濃縮を行った後のリカバリーを推定するのに使ったりしています。 どのような実験をされているのかわかりませんがもしDNAのコンタミが 実験上問題になるのなら念のためDEAEの様な陰イオン交換カラムを 使って確実にDNAを除いておいたほうがいいかもしれませんね。 もちろんDNAがカラムよりも転写因子に強く結合するようなら （おそらくそんなことはないと思いますが）分離できませんが。

(無題) 削除/引用 No.2029-9 - 2008/09/29 (月) 18:58:48 - きりん ひちみさん、もとぽすどくさん、ありがとうございます。 ＞ちょっと思ったのですが．．． 転写因子ってDNA結合性のですか？ 大腸菌で発現させると、DNAとくっついてる状態のが結構とれるらしいですが、その辺は確認されましたか？ 　はい。ご指摘の通りでリコンビナントとしている転写因子はDNA結合性です。ホモ二量体をつくって特定配列（6 bp）に結合すると報告されています。大腸菌で発現させるとDNAとくっついている状態となるというのは、大腸菌の細胞質内でDNAと結合してしまっているということですか？ 　そのような現象は初めてお聞きしました。大変勉強になります。 ＞タンパク質の定量を吸光度で行うこともあると思いますが、核酸とタンパク質の吸光係数を比べてみればわかるように、核酸のほうが桁違いで高いです。ですので、ごく微量でもこんたみがあれば十分260と280がひっくり返ることはありえます。 この吸光係数が小さいという理由で、タンパク質の定量を吸光度で行うことはかなり不確かになってしまうケースが多いです（トリプトファンがたくさんあれば別ですが）。ちなみにフェニルアラニンなんかは260に吸収がありますよ。 　原理を教えていただいてものすごく納得しました。勉強になります。 除核酸処理は行っていませんでした。精製時に除核酸処理を行って、タンパクの定量はキットでやってみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.2029-8 - 2008/09/29 (月) 18:58:34 - qq tritonが透析で十分に抜けていない。tritonもphenolと同じあたりに吸収がありますよ。

(無題) 削除/引用 No.2029-7 - 2008/09/29 (月) 18:40:52 - きりん おおさん返答ありがとうございます。 ＞ちょっと今計算する余裕がありませんけど、エチブロで検出できるくらい乗っているとお考えですか? 　はい。A260がほとんど核酸によるものと仮定して計算すると、0.1 mg/mLくらいになったので 検出できるかもしれないと考えました。 ＞おそらくなにか交じっているのだと思います。 精製方法をもう少し詳しく書かれた方がいいのではないでしょうか。 あとタンパクは何に溶けてますか?0点をバッファーで合わしたとしてもバッファーがUV領域でつよい吸収を持っていれば、ちゃんとはかれていないかもしれません。 　 　情報が少なくて申し訳ないです。 　目的タンパクをGST融合タンパク質として大腸菌で発現、誘導後に菌ペレットをTris系バッファーに溶かし、超音波破砕、終濃度1%のTritonXで可溶化、Gluthatione ビーズを用いてバッチ法にて精製しています。その後Preccision proteaseでGSTの切り出しを行い、最後にPBSで透析しています。 　別のコンストラクトを用いてGSTのみを精製したときはA280にきちんと吸収極大がありました。 proteaseによる切り出し以降の操作に問題があるのでしょうか・・・

除核酸処理はしましたか？ 削除/引用 No.2029-6 - 2008/09/29 (月) 18:34:31 - もとぽすどく この転写因子は核酸結合性なのでしょうか？ どのような精製をされたのか書かれていないのでなんとも言いがたいですが、核酸結合性であれば、核酸のこんたみも十分考えられると思います。 タンパク質の定量を吸光度で行うこともあると思いますが、核酸とタンパク質の吸光係数を比べてみればわかるように、核酸のほうが桁違いで高いです。ですので、ごく微量でもこんたみがあれば十分260と280がひっくり返ることはありえます。 この吸光係数が小さいという理由で、タンパク質の定量を吸光度で行うことはかなり不確かになってしまうケースが多いです（トリプトファンがたくさんあれば別ですが）。ちなみにフェニルアラニンなんかは260に吸収がありますよ。

(無題) 削除/引用 No.2029-5 - 2008/09/29 (月) 18:30:41 - ひちみ ちょっと思ったのですが．．． 転写因子ってDNA結合性のですか？ 大腸菌で発現させると、DNAとくっついてる状態のが結構とれるらしいですが、その辺は確認されましたか？

(無題) 削除/引用 No.2029-4 - 2008/09/29 (月) 18:08:48 - きりん ひちみさん、返答ありがとうございます。 ＞紫外部に吸収のある物質は核酸だけではありません。 ないものを探すほうが大変ではないでしょうか。 　混入しているものは核酸に限らないということですね。 ＞ご質問の状況だと、濃度測定のコントロールには透析外液を用いるのが適当と思われます。 この辺はどうしてるでしょうか？ 　濃度測定のコントロールには透析外液（PBS）を用いています。 ＞また、タンパク定量にUV吸収は普通用いません。 上記の理由でノイズが排除できないからです。 ブラッドフォード法やローリー法によるキットが市販されてると思うので、それをご検討されては。 　そうなのですね。ラボの先輩に相談して、キットでの濃度測定に切り替えたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2029-3 - 2008/09/29 (月) 18:04:47 - おお >[Re:1] きりんさんは書きました : > 　核酸の混入を疑い、この溶液を１％アガロースゲルで電気泳動した後 > エチブロで染めてみましたが、DNAやRNAの様なものは確認できませんでした。 ちょっと今計算する余裕がありませんけど、エチブロで検出できるくらい乗っているとお考えですか? > > 　タンパク質の吸収極大は280 nmというのが常識だとは思いますが、 > この吸収極大が260 nm付近に移動することなどあるのでしょうか？ > 　またあるとしたらどのような原因が考えられるのでしょうか？ > おそらくなにか交じっているのだと思います。 精製方法をもう少し詳しく書かれた方がいいのではないでしょうか。 あとタンパクは何に溶けてますか?0点をバッファーで合わしたとしてもバッファーがUV領域でつよい吸収を持っていれば、ちゃんとはかれていないかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2029-2 - 2008/09/29 (月) 17:59:28 - ひちみ 紫外部に吸収のある物質は核酸だけではありません。 ないものを探すほうが大変ではないでしょうか。 ご質問の状況だと、濃度測定のコントロールには透析外液を用いるのが適当と思われます。 この辺はどうしてるでしょうか？ また、タンパク定量にUV吸収は普通用いません。 上記の理由でノイズが排除できないからです。 ブラッドフォード法やローリー法によるキットが市販されてると思うので、それをご検討されては。

タンパク質の吸光度 削除/引用 No.2029-1 - 2008/09/29 (月) 17:53:59 - きりん 　タンパク質の吸光度について質問させてください。 　現在ある転写因子のリコンビナントを大腸菌で発現、精製しています。 透析を終えた段階でこのタンパク質の吸光度測定を行ったところ、 A280よりもA260の値が大きく出てしまいました。（A280/260=0.46程度です・・・） 　 　SDSPAGE・CBB染色では目的タンパク質（30 kDa）を確認できています。 　核酸の混入を疑い、この溶液を１％アガロースゲルで電気泳動した後 エチブロで染めてみましたが、DNAやRNAの様なものは確認できませんでした。 　タンパク質の吸収極大は280 nmというのが常識だとは思いますが、 この吸収極大が260 nm付近に移動することなどあるのでしょうか？ 　またあるとしたらどのような原因が考えられるのでしょうか？ 　要領を得ない質問で申し訳ありませんが、どなたか詳しい方がいたら ぜひ教えてください。

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