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ｄNTP 削除/引用 No.2024-8 - 2008/09/28 (日) 17:05:47 - あああ 私が昔PCRをかけてだめだったとき、いろいろ悩んだ挙句、結局ｄNTPがだめになっていただけのことがありました。 ほんの1週間前までは使えていたものだったのに、何かの拍子にだめになっていたようです。 （個人もちのものではなく、何人かで使いまわしていたものだったので、原因は分かりませんでしたが） すでにチェック済みとは思いますが、念のため。。。

(無題) 削除/引用 No.2024-7 - 2008/09/28 (日) 11:28:46 - AP >今回、初めて遺伝子に触れ出した研究室の者なので『そんな事も・・・』と言うような質問かもしれませんが、なにとぞご助力ください。 やりなれていない手技なら、他の人がルーティンにこなしていることでも、すんなり行かなくて当然だと思って、もう少し試行錯誤してみては。最初からなんのつまづきもないでさくさく入いってしまうと、原理や基本をろくに知らないでマニュアルどおり試薬をまぜればよしという科学者らしからぬ人間になってしまうかも。 PCRに関しては数々の教科書もあり、各メーカーも親切な資料を提供してくれています。少なくとも使用メーカーの資料くらいはよく読んで、パラメータのいじり方、tips、トラブルシューティングなど検討してみてください。 > プライマーは > GAGCTCCAACTATACTACAATGCC > や > GGATCCTTCTTAGACGAAGATAGG > 等を利用しました。 プライマーの設計を支援するソフトウェアがいろいろありますが、そういうの利用していますか？　プライマーダイマーや二次構造の危険性を排除したり、PCRのシミュレーションで副産物ができる可能性を示してくれたりします。 末端の制限酵素認識配列がゲノム由来でないものを付加しているなら実質18 bpくらいのプライマーになりますが、ゲノムからのPCRだとちょっと短すぎるかな。私は、23 bp前後の相補配列プラス制限酵素サイトのtailにします。 老婆心ですが、PCR産物をクローニングするために末端に制限酵素サイトをデザインしているなら、端ぎりぎりにある認識サイトは切れません。使う制限酵素によりますが、一般的に端から3-6 bp程度の余裕が必要です。

(無題) 削除/引用 No.2024-6 - 2008/09/28 (日) 05:13:41 - おお >[Re:3] わちょさんは書きました : > Pichia stipitisという菌株です。 > 確かにイントロンを含んだ部分でプライマーを作っているんで、そこが問題だったかも・・・。 いや、染色体からPCRしているのでしたらそういう問題なのかもう一度考えるべきです。酵母のイントロンならそんなに長くないのでcDNAより長いプロダクトが増幅してもおかしくないと思います。 １度ゲノムから増えるPCR断片の長さを確認してください。 もし、cDNAのエクソンジャンクション上にプライマーを設定しているなら、問題があるかもしれません。 > プライマーは > GAGCTCCAACTATACTACAATGCC > や > GGATCCTTCTTAGACGAAGATAGG > 等を利用しました。 プライマーはいきなり制限酵素認識配列と思われるパリンドロームで始まってますけど、PCR断片をその制限酵素で処理してプラスミドにインサートするつもりでしょうか?このプライマーでそれはちょっと難しいかもしれません。 > > > アニーリング温度を下げてとりあえずバンドが出ればいいのであれば > > もうちょっと下げた方が良いのではないでしょうか？40℃とか。 > > うちでは55℃は普通にPCRするときに使ってる温度です。 > > とりあえずバンドが出れば良い、と考えたわけではなく。一度ＰＣＲを行った際にバンドが出なかったため、塩濃度を上げたうえでＤＮＡポリメラーゼの使用範囲？の最低温度でアニーリングを行ったという経緯です。 > 初回塩濃度50mMで行った所を、二回目は0.5Ｍ、三回目で1.0Ｍで行いました。 Taq系とPfu系の酵素では最適なバッファーの組成がちがいます。自作のバッファーでしたら、そこを見直さないといけないかもしれません。APさんが触れていますように、一般的にはナトリウムよりカリウムがバッファーに中に入ってますね。それと、塩濃度は一般的に(特殊な理由がないかぎる)いじる人はいないと思います。いちどPCRの系自身動いているか何でもいいから増幅してみるのも必要かもしれませんよ。 プライマーをみると末端がパリンドロームなので実際にDNAにアニールするのが18ぐらいでしょうか、、、そうであれば、45度とかぐらいまでアニーリング温度を落とせるかもしれません。配列からのTm値はPCRの条件を決めるための絶対的な値ではありませんので、参考程度と考えてフレキシブルに温度を設定して良いと思います。 PCRが開発された当初は20merもあればプライマーとして特定の遺伝子を増やすのに(数学的に)十分な長さといわれていましたが、現在はそれでも長めに設計する人が多いです。それのほうが増幅しやすいからです。25マーぐらいは取って良いと思います。制限酵素切断部位を末端に入れるなら33-35マー位になるかもしれません。もしプライマーを設計し直すなら参考にとおもいました。 現状でいくなら、APさんが仰ってますようにバッファー、マクネシウム、塩濃度はいじらず、アニーリング温度を下げて行くのがいいと思います。でノンスペを含んでいたとしてもバンドがでれば、その時点で次にどうしようという解決策が取りやすくなります。 たとえば そこでマグネシウム濃度を下げる人もいるでしょうし、DMSOやベタインなどの添加物を加えて見る人もいるでしょうし、ノンスペのバンドが長いところにくるなら、伸長反応時間を短くとるのもてですし、タッチダウンというアニーリング温度をサイクルごとに下げていく方法もあります。

(無題) 削除/引用 No.2024-5 - 2008/09/27 (土) 22:57:11 - AP PCRのパラメータでナトリウム塩濃度をいじるというのは普通ではないです。 そういう参考文献がなにかあったんでしょうか。 耐熱性ポリメラーゼの反応バッファの塩濃度はKClで調整されているものですし、アニーリングなどPCRの条件を振るときは、Mg++濃度を0.5-3.0 mMくらいの範囲で振るものですが。 まあ、それも調製が面倒なので、たいていはデフォルトの1.5 mM Mg++で固定して、アニーリング温度を振ります。それでだめだったらパラメータをいじってなんとかするより、プライマーを変えるのが解決が早いし労力やコストも少なかったりします。今は、プライマーの外注が早くて安いですから。

(無題) 削除/引用 No.2024-4 - 2008/09/27 (土) 21:52:19 - student 始めて行う実験は何事もポジティブコントロールが大切だと思います。 ＰＣＲをほとんど扱ったことがないような研究室であれば、 とりあえず、何かの論文（できれば知り合いのラボで実際に使用しているような）からすでに使用されているプライマーを作って、実際にうまくいくかどうかを見てみたほうがよいと思います。 そうすれば全体的な手法がまずいのか、今回のプライマーに関してよくないのかが分ってくると思います。

早い返答ありがとうございます 削除/引用 No.2024-3 - 2008/09/27 (土) 21:20:08 - わちょ > 酵母株はなんでしょうか？株によっては標準株とシークエンスが異なる場合が > あり、ちょうどそこにプライマーがあれば当然掛かりません。 Pichia stipitisという菌株です。 ＮＢＲＣから分譲してもらった物で、NCBIにゲノムが登録されている菌株の一つです。 プライマーについては、その菌株のBlast検索から目的ＤＮＡ断片を増幅できるように設計しました。 確かにイントロンを含んだ部分でプライマーを作っているんで、そこが問題だったかも・・・。 プライマーは GAGCTCCAACTATACTACAATGCC や GGATCCTTCTTAGACGAAGATAGG 等を利用しました。 > アニーリング温度を下げてとりあえずバンドが出ればいいのであれば > もうちょっと下げた方が良いのではないでしょうか？40℃とか。 > うちでは55℃は普通にPCRするときに使ってる温度です。 とりあえずバンドが出れば良い、と考えたわけではなく。一度ＰＣＲを行った際にバンドが出なかったため、塩濃度を上げたうえでＤＮＡポリメラーゼの使用範囲？の最低温度でアニーリングを行ったという経緯です。 初回塩濃度50mMで行った所を、二回目は0.5Ｍ、三回目で1.0Ｍで行いました。 > 抽出したDNAは泳動しましたか？ > 分解が激しければ掛からないと思います。 かけていませんでした。実際に濃度はどれくらいだとバンドが現れるのでしょうか？ 一度かけてみます。 > 抽出したDNAをどれくらいに希釈してPCRをしましたか？ 鋳型ＤＮＡについては2μg/mlの濃度でＰＣＲをかけました。

(無題) 削除/引用 No.2024-2 - 2008/09/27 (土) 19:17:23 - やま 酵母株はなんでしょうか？株によっては標準株とシークエンスが異なる場合が あり、ちょうどそこにプライマーがあれば当然掛かりません。 アニーリング温度を下げてとりあえずバンドが出ればいいのであれば もうちょっと下げた方が良いのではないでしょうか？40℃とか。 うちでは55℃は普通にPCRするときに使ってる温度です。 どれくらいTmが低いのか分からないですがいきなり塩濃度をいじる必要はないと思います。 でも今35サイクルで出ないのであればそのプライマー （プライマー以外に問題がある場合は別ですが）は使えないと思います。 抽出したDNAは泳動しましたか？ 分解が激しければ掛からないと思います。 抽出したDNAをどれくらいに希釈してPCRをしましたか？ できればプライマーの配列を書いてみては？

PCRを行いましたが、バンドが出ない 削除/引用 No.2024-1 - 2008/09/27 (土) 18:49:28 - わちょ 初めまして。参考にさせていただいています。 題の通りなのですが。 酵母からの遺伝子抽出を行い、PCRにかけていざ電気泳動を行ったところ、バンドが出ないという状況に陥っています。 菌体から抽出した染色体DNAは、 OD260/280=2.06 プライマーは何度も確認しましたので、間違いは無いと思います。GC％も全て50％にやや届かない位のものです。プライマーの長さは24塩基です。 PCR溶液中に必要な物質は全て一つずつチェックして入れているので、間違いは無いと思います。 Tm値がやや低かったためナトリウム塩濃度を1.0〜0.5Mにした後、とりあえずアニーリング温度を低くすれば何か出ると書いてあったものがあったので、アニーリング温度を55℃として35サイクル反応を行いました。 電気泳動の際、分子量マーカーの部分はしっかりバンドが出ているため、ゲルの不備は無いと思います。 鋳型のDNAに問題があるのではないかと考え、もう一度DNA抽出から始めて、PCRに持っていこうかと考えているのですが、何か問題がありそうな部分、或いはこの部分が抜けているといった物は無いでしょうか？ 今回、初めて遺伝子に触れ出した研究室の者なので『そんな事も・・・』と言うような質問かもしれませんが、なにとぞご助力ください。

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