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補足 削除/引用 No.2015-15 - 2008/09/27 (土) 16:39:00 - ＩＲＥＳ mutagenesisの理解は例えばタカラ社のkitの説明書を読むと理解できるでしょう。このkitを買う必要があるかどうかは読んで判断してください。PCRの知識も無いのであれば難しいかもしれませんが... http://catalog.takara-bio.co.jp/PDFFiles/R046A_j.pdf

(無題) 削除/引用 No.2015-14 - 2008/09/27 (土) 15:19:29 - student student様がご提案されたようにドミナント・ネガティブ変異体が報告されているか検索しましたが、調べ方が悪いのか，無いようです。 > もしご存じなければ pubmedでの検索ですとアブストまでしか検索対象にならないので、 Google scholar http://scholar.google.co.jp/ であれば本文も検索できるのでそちらで検索してみることをお勧めします。

(無題) 削除/引用 No.2015-13 - 2008/09/27 (土) 15:18:47 - ＩＲＥＳ dominant negative変異体を作るということはその対象タンパク質の分子機能を良く理解していないといけませんし、機能未知であるならば類似タンパク質の分子機能を熟知しなければなりません。 分子生物学が初心者とのことですのでBossはその辺りも考慮されたのではないでしょうか。いずれにしてもここで安易に回答を求めるのではなくて、勉強をするべきことだと思います。Bossをがっかりさせなければ良いのですが...

(無題) 削除/引用 No.2015-12 - 2008/09/27 (土) 12:35:54 - AP >あるpolymeraseをコードする遺伝子をdominant negativeによって不活性にした際に、それによって制御されているであろうと思われるhomeobox gene（まだ論文には載ってないが）の動態を知りたい、 特定の遺伝子の転写を行うRNA polymerase IIのサブタイプがあるということでしょうか。そういう場合にどれだけ一般化できるのかわかりませんが、RNAPIIはよく調べられていて、どのサブユニット、ドメイン、アミノ酸残基がどういう機能に必要であるかということが詳しくわかっているはずですね（私はよく知りませんが）。dominant negative効果があるかどうかはわかりませんが、例えば伸長活性に必要なC末端ドメインや、リン酸化が起こるセリン残基をいじると活性を失うというようなことは実験的に行われているようです。 伸長活性はないけれど、initiation complexに結合するというようなmutant タンパク質を過剰に発現させれば、正常なPNAPIIを追い出して効果があるかもしれません。 まず、RNAPIIにmutationを導入して機能ドメインを解析しているような論文（これは山ほどある）から研究してみるといいのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2015-11 - 2008/09/27 (土) 05:35:28 - おお >[Re:10] 困ったちゃんさんは書きました : > 超ド素人の私のトピにいろいろご返事ありがとうございます。 > > 私の情報不足で皆様によけいな時間を取らせたと思います。本当にすみませんでした。 > > まずほとんどの方に誤解を招いたのですが、iRNAについては、最初私もボスにiRNAで？と聞いたところあっさり否定され「dominant negativeでknockdownする」と断言された為このトピをたてさせていただいたという経緯があります。 この理由を考慮しないでドミネガを作ろうとすると、間違えを起こすかもしれませんよ。どうも、ドミネガは貴方の興味ある遺伝子の制御を優先的にブロックしたいのでは(RNAiではすべて転写に影響が出ますから)と言うにおいがします。 > > 変異株を作りクローニングしそれを導入するという操作は私にとって初体験なのです。 > テクニカルなことは、キットを使わせてもらえるなら、それで勉強しなさい。メカニズム、方法論すべて丁寧に書かれていますし。プロメガとか日本語のプロトコールも日本のWEBページ行けば日本語でも読めるのでは、、、

ありがとうございます。 削除/引用 No.2015-10 - 2008/09/27 (土) 02:22:35 - 困ったちゃん 超ド素人の私のトピにいろいろご返事ありがとうございます。 私の情報不足で皆様によけいな時間を取らせたと思います。本当にすみませんでした。 まずほとんどの方に誤解を招いたのですが、iRNAについては、最初私もボスにiRNAで？と聞いたところあっさり否定され「dominant negativeでknockdownする」と断言された為このトピをたてさせていただいたという経緯があります。ですからその「dominant negativeがknockdownか否か」といった語法は後々勉強させていただく事として、パシリ様のおっしゃるようにRNAi-inducedのノックダウンではないようです。 そこで少し詳しくお話しすると、あるpolymeraseをコードする遺伝子をdominant negativeによって不活性にした際に、それによって制御されているであろうと思われるhomeobox gene（まだ論文には載ってないが）の動態を知りたい、ということなのです。iRNAについてなぜ、否定されたかはわかりません(論文には存在し、他のlabですでに使用しているようです。）。student様がご提案されたようにドミナント・ネガティブ変異体が報告されているか検索しましたが、調べ方が悪いのか，無いようです。 変異株を作りクローニングしそれを導入するという操作は私にとって初体験なのです。

(無題) 削除/引用 No.2015-9 - 2008/09/26 (金) 13:37:04 - AP おそらく、実際上、他の方のおっしゃるようなusageが一般的なんでしょうが、 dominant negativeという概念とknockdownという概念とは、必ずしも排他的なものではないです。異なる起源から生まれた概念なので重なるところも多いですし、手法で定義された用語というより、現象をさす用語と理解したほうがいいと思います。 knockdownは、後天的、人為的に遺伝子発現を抑制・ブロックすることです。 それを実行する手法のうちのひとつで、現在最も広く使われている有力なものがRNAiということに過ぎないと思います。 RNAiでknockdownした場合、見識ある人の論文なら、必ず「knockdown by/with RNAi/siRNA」」書いていると思いますよ。knockdown=RNAiという風に理解する人、使う人もいますが、もしそれがコンセンサスなら、わざわざ by RNAiなんて書く必要はないわけです。 手段のひとつにdominant negativeも含まれると考えて、「dominant negativeでknockdownする」というのも間違いとはいえないと思います。 dominant negativeは、正常遺伝子から改変された、優性で遺伝子の機能を阻害する一種のalleleによって、正常遺伝子の機能に阻害が起こるようなことをさすと思います。inverted repeatのコンストラクトを遺伝子導入したものも「、正常遺伝子から改変したallele」の一種だと解釈を広げると、「RNAiでdominant negativeを起こす」というような表現をすることも間違いとは言い切れないと思います。

(無題) 削除/引用 No.2015-8 - 2008/09/26 (金) 11:49:41 - yt もしドミナント・ネガティブ変異体が報告されてるならば、そのラボから貰うのが一番早いい安上がりでしょうね。 報告されてるけれども貰えない事情があって作らなくてはいけないのなら、その遺伝子がクローニングされてるものが手元にあるなら、部位指向性変異導入で変異体を作れるし、クローニングされたものが無いならばどっか会社からORFの入ったﾌﾟﾗｽﾐﾄﾞを購入して変異体を作るしかないでしょうね。 もし、報告されてないならば、文献を読んで機能に関与してそうな部分（活性中心とか）に片っ端から変異を入れてみて、その中からﾄﾞﾐﾈｶﾞになるものを選ぶしかないのではないでしょう。もっとも必ずしもﾄﾞﾐﾈｶﾞになるかは分かりませんが。

(無題) 削除/引用 No.2015-7 - 2008/09/26 (金) 11:47:04 - aji > ドミナントネガティブを用いることで元々のタンパク質の機能を阻害する場合にはノックダウンという言葉は用いないような気がします。 ボスが言ったという言葉そのものがどうだったのか気になるところではありますが、積極的に解釈して、RNAiが出来ない生物でドミナントネガティブをノックダウンの代わりにやってみよう、ということはありそうですか。 最近生物学的な実験を始めた、ということは分子生物学的なのも初めてでしょうか。それなら本当の初歩からボスか、面倒を見てくれる人に教えてもらえば良いだけのような気がします。知らないことを知っているふりすると、後が大変ですよ。

(無題) 削除/引用 No.2015-6 - 2008/09/26 (金) 11:40:23 - パシリ 英語でknock downすると言ったのだから、いわゆるノックダウン（RNAi-inducedの）の含みは無いんじゃ？

(無題) 削除/引用 No.2015-5 - 2008/09/26 (金) 10:40:09 - K ドミナントネガティブを用いることで元々のタンパク質の機能を阻害する場合にはノックダウンという言葉は用いないような気がします。 RNAiで内在性の正常なタンパク質をノックダウンした上で、RNAiが聞かないようなドミナントネガティブタンパク質（RNAiの標的配列を改変、もしくはRNAi標的配列を5' or 3'UTRに設計する）を発現させて観察しろという意味ではないでしょうか？間違っていたら申し訳ありません。 ドミナントネガティブになるには酵素活性をpoint mutationやドメインごとdeletionしたものを用いるのが一般的ではないでしょうか？酵素活性がもともと無いのであれば、目的タンパク質との結合に必要な最小配列のみを発現させるというようなケースもあるかも知れませんが。

(無題) 削除/引用 No.2015-4 - 2008/09/26 (金) 09:55:20 - student 文章を読んだ限りで想像で書くと ボスがいきなりそう言うということはおそらくそのｘｘｘのドミナントネガティブミュータントが論文で報告されているのだと思います。 どんな遺伝子か知らないので、どのようなドミナントネガティブミュータントはわかりませんが、おそらくｘｘｘのポイントミューテーションかトランケートフォームの過剰発現なんじゃないですか？ で、おそらく過剰発現だけではエンドのｘｘｘが阻害できずにドミネガのフェノタイプがでないので、エンドのｘｘｘをノックダウンしたときにドミナントネガティブミュータントで機能をレスキューできるのかどうかをおそらく下流の遺伝子ｙｙｙで観察しろというこでしょうか。その場合はｘｘｘをsiRNA resistanceにした遺伝子を使用する方法がよくあります。 とりあえずまずはxxxのドミナントネガティブミュータントとsiRNA resistanceをキーワードに文献を読んでください。

(無題) 削除/引用 No.2015-3 - 2008/09/26 (金) 06:42:03 - おお 一概に作り方といった決まったアプローチは適用できるかどうか見定める必要があります。まずあなたのたんぱく質の活性は何ですか?キナーゼですか、それとも何かと相互作用することにより、そのパートナー(下流)にシグナルを伝達するような物でしょうか?その結合はたんぱく質の修飾により制御されていますでしょうか?その修飾により活性化しますか、不活性化しますか?また、その遺伝子がプロテアーゼだったら、、、、 それぞれにおいて違うアプローチが取れると思えませんか? まずはその遺伝子の性質をよく考えて、どうしたらドミナントネガティブになりうるかをよく考えてください。同じたんぱく質でもアウトプットの考え方によって作り方が違ってくるかもしれません。それと、作ったものがドミナントネガティブである事を検証するあっせい系も必要ですよ。 ま、英語ですがPUBMEDでその遺伝子の事を調査するところから初めて見てはどうでしょうか? よく分からなければ直接遺伝子をRNAiでノックダウンしてもいいかもしれませんが(実験によってはそれで見れないかもしれませんか)。

(無題) 削除/引用 No.2015-2 - 2008/09/26 (金) 01:37:52 - うーん つhttp://www.google.co.jp/search?hl=ja&q=dominant+negative+mutantの作成&btnG=Google+検索&lr=&aq=f&oq=

dominant negative mutantの作成について 削除/引用 No.2015-1 - 2008/09/26 (金) 01:32:33 - 困ったちゃん 最近生物学的な実験を始めたばかりで、なおかつ渡米中の初心者です。 ボスにいきなり，「XXXという蛋白のdominant negative mutantを作成して、それによってXXXをノックダウンしそのときのYYYという蛋白の状態を観察しろ。」といわれました。 dominant negative mutantの作成はどうするのでしょうか。また、それを使った遺伝子Knockdown実験の簡単な手順を教えていただけないでしょうか。 ここには日本語の実験書も売ってなく、非常に参ってます。 洋書を見ろ，といわれそうですができれば日本語で理解したいのです。 もしダメなら，参考URLでも良いのです。 何卒よろしくお願いいたします。

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