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(無題) 削除/引用 No.2014-17 - 2008/09/29 (月) 16:47:06 - EcoRI 暇人A様 ありがとうございます。 言われてみれば、確かに、仰る通りです。 Chain1とChain2は分子量にして50 kDa程度の差がありますので、 両端にHisTagがあって、抗HisTagで両者を検出 抗mycでChain2を検出で おそらく問題ないと考えました。 今回は、個人的に馴染みのあるHisTagを取り上げましたが、 PCRでタグを挿入するのですから、HisTagに拘らなければならない理由はないです。 より明瞭な結果を得るために、別のタグ、例えばFLAGなどが適当かと思います。

(無題) 削除/引用 No.2014-16 - 2008/09/29 (月) 15:11:15 - 暇人A EcoRIさま 言いたかったのはchain1の検出およびchain1-chain2がつながっているときの検出の場合です。特につながっているときは両端にHisがついているので分かりにくくならないかと。 分子量で分かるとは思いますが、他の人が見てすぐに解釈してくれるかどうかという点が気になりました。

(無題) 削除/引用 No.2014-15 - 2008/09/29 (月) 14:48:25 - EcoRI 暇人A 様 C末にベクター由来のmycタグも付いておりますので、 Chain2の検出には抗myc抗体を使えば可能と考えております。

(無題) 削除/引用 No.2014-14 - 2008/09/29 (月) 13:14:59 - 暇人A 素朴な疑問ですが、検出を具体的にどうするかわからないが、chain2にHisタグを持っているのにchain1にもHisタグをつけて検出のときわかりにくくならないですか？ 特にS-S結合がつながったままで検出する場合はchain１にもHisタグがつているかわからなくなると思うのですが。 さらに別のタグをつけるか、chain2のHisタグを除くほうがいいと思います。また、Hisはなんかくせがあって好きじゃないです。

(無題) 削除/引用 No.2014-13 - 2008/09/27 (土) 16:38:14 - EcoRI >主題とは少し外れるのですが、His-tagを持ったタンパク同士は非特異的にaggregatesを作りやすいので気をつけた方が良いと思われます。 これは初見です。 貴重なご意見、ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.2014-12 - 2008/09/27 (土) 12:17:02 - yt 主題とは少し外れるのですが、His-tagを持ったタンパク同士は非特異的にaggregatesを作りやすいので気をつけた方が良いと思われます。 　 活性化されてChain1とchain2がheterodimer(?)を作るとのことですが、Chain2にもHis-tagがあるのが気になります。活性化とは無関係に「複合体」を作ることも可能性としてあると思われるので注意した方が良いです。

(無題) 削除/引用 No.2014-11 - 2008/09/26 (金) 22:57:12 - EcoRI ありがとうございます。 A様の解釈に間違いはないです。 どこにタグを仕込むか、が一番難所になりますね >Histagの位置が仮にタンパク質の真ん中に来たとしても市販のAntiHis（私は SIGMAのantiHisで検出できました）を使いWBで検出できます どうもタグというのは、末端になければならない、という固定観念があったようです。 WBで検出できるなら、作ってみても… >まずはNativeのタンパク質を発現させてその上でN末の切断サイトを確認してから上に >述べた方法で同じようにコンストラクトを作られてはという提案です。 １つ目の提案よりは、よりネイティブな形のタンパク質が得られそうですね。 >もしできない場合でもマススペクトルをはかることによって決定できると思います。 これは、初見です。 なるほど…マスで飛んだイオンの分子量から推測する、ということですね。 それから、自分で書いてなんですが、よく考えた結果、 やっぱりドメインの間にTagを仕込むのは、やめておきます。 フォールディングに影響がでそうです。 ご迷惑をおかけしました。 もうすこし論文などを読んでから、系を建ててみたいと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2014-10 - 2008/09/26 (金) 18:17:18 - A ここで示されているシグナルペプチド（ここでいうPAGEWES）というのは いわゆるpro配列のことだと思っているのですが（つまり分泌後に切断 されてしまう）認識間違っていますか？そしてEcoRIさんが欲しいのは 最終的に分泌された後でもN末にHis-tagがついているタンパク質かと 思うのですが如何ですか？この前提で示されている図を使うと私が 提案したかったのは Met..SDS PAGEWES TERNE...Histag-TERNELI...C terminus といった感じです。これなら多分フォールディングもいけそうですし Histagの前に短い配列が残ると思いますがほぼ目的のタンパク質が 得られるのではないかと思った次第です。切断サイトからHistagの前 までにどれぐらいの配列を入れる必要があるのかは難しいところですが 切断サイトの前後がプロテアーゼの認識配列になりますから最低でも TERNEまでぐらいは入れたいところです。後はこの付近の配列の何処まで がフォールディングにかかわっているかでその情報があるのであれば どれ位の長さにする必要があるのかはっきりしてくるのではないかと 思います。この決定はかなり難しいかと思います。場合によってはHistag の前にかなり長い配列が残る場合もありますが前にも書いたようにHistag の位置が仮にタンパク質の真ん中に来たとしても市販のAntiHis（私は SIGMAのantiHisで検出できました）を使いWBで検出できます（私はSIGMAの antiHISを使い検出しました。シグナルは通常よりも弱くなります。）。 2番目の提案はもしシグナル配列の切断サイトの確からしさが明確でない ならば（他種のホモログの幾つかで既に切断サイトが確認されていて アライメントでほぼ確実なら必要ないと思いますが）、まずはNativeの タンパク質を発現させてその上でN末の切断サイトを確認してから上に 述べた方法で同じようにコンストラクトを作られてはという提案です。 N末のブロックを気にされているようですがN末のブロックをはずすキット も幾つか発売されていますし、もしできない場合でもマススペクトルを はかることによって決定できると思います。実際にブロックされている N末の位置をマススペクトルで推定した論文を見たことがあります。 もし私の認識が間違っているようでしたら改めて書き込んで頂けますか。

(無題) 削除/引用 No.2014-9 - 2008/09/26 (金) 12:00:02 - おお >[Re:8] EcoRIさんは書きました : > Chain1は複数の、タンパク質の活性化に関与しない(別の相互作用には非常に重要な)ドメインからなっています。 > ですので、例えば、 > N-Sig-ドメイン１-HisTag-ドメイン２-ドメイン３- > となるようなコンストラクトを作製するのも手だと思います。 > こうすれば、少なくとも活性化は見られると思います。 じゃあそれにしなさいって。

(無題) 削除/引用 No.2014-8 - 2008/09/26 (金) 11:47:47 - EcoRI Chain1は複数の、タンパク質の活性化に関与しない(別の相互作用には非常に重要な)ドメインからなっています。 ですので、例えば、 N-Sig-ドメイン１-HisTag-ドメイン２-ドメイン３- となるようなコンストラクトを作製するのも手だと思います。 こうすれば、少なくとも活性化は見られると思います。 また、このコンストラクトを用いれば、シグナルの切断も見ることができるかもしれません。 その上で、別にコンストラクトを作り直して、 活性化や相互作用をみる、ということも可能かなぁと思います。 ですが、他種のホモログにおいては、そのようなコンストラクトの報告は知りません。 というよりは、他種のホモログでは精製法がワンステップのカラム精製でできるので、 N末にタグをつけるなどということはしないのが常です。

(無題) 削除/引用 No.2014-7 - 2008/09/26 (金) 10:41:46 - おお ん、まてよ、それでも場合によってはTagのC末がわで切られる可能性があるか、、、、、 難しいですね。 >[Re:6] おおさんは書きました : > わたしならもっとてのこんだ方法を取るかもしれません。 > ..... >ですからTag-AAMSDSPAGEWESTERNな感じでしょうか。 > 機能ドメインとありながら、そのＮ末が削れていることを考えるとちょっとふに落ちないので、ちょっとうのみにできない感があります。 > > あるいはその配列をどうしても使う場合であれば、 > MSDSPAGEWESTERNELIEESDS-Tag-AAAPAGEWESTERNぐらいでしょうか。 > N末20-25アミノ酸はるべく同じにしておいて、十分機能するようにしておき、.....

(無題) 削除/引用 No.2014-6 - 2008/09/26 (金) 10:37:18 - おお わたしならもっとてのこんだ方法を取るかもしれません。 まず分泌タンパクで、シグナルペプチドの後にタグをつけた例を探し、そのN末からタグの部分までを同じアミノ酸配列にして、そのあとに機能ドメインのN末とお考えのPAGEWESTERNをつなげる。いきなりPAGEWESTERNをタグの後ろに入れるよりは数アミノ酸をリンカーとしていれるだろうなとおもいます。ですからTag-AAMSDSPAGEWESTERNな感じでしょうか。 機能ドメインとありながら、そのＮ末が削れていることを考えるとちょっとふに落ちないので、ちょっとうのみにできない感があります。 あるいはその配列をどうしても使う場合であれば、 MSDSPAGEWESTERNELIEESDS-Tag-AAAPAGEWESTERNぐらいでしょうか。 N末20-25アミノ酸はるべく同じにしておいて、十分機能するようにしておき、タグをはさんで機能ドメインから始める。まず切れると予測される位置とその前後はいじりたくありませんから。それと酸性アミノ酸はERに入る時の１時的なトポロジーに関係するような気もします(結局は切れてER内に放出されるのですが、その前にトポロジーが狂って局在が狂わないかとか心配なきがします)。 でもここまでうまく行くかどうか分からない理屈をこねて作るよりは前者の方が安心できると思います。

(無題) 削除/引用 No.2014-5 - 2008/09/26 (金) 09:43:42 - EcoRI 返信、ありがとうございます。 もう少し具体的に書いた方がいいですかね。先に長文をお詫びします。 目的タンパク質は分泌型で、CHOやバキュロでの発現を想定しています。 簡単のため、Chain2は考えないことにします。 Met..SDS PAGEWES TERNELI...C terminus という配列において、 機能的なドメインはPAGEWESTERNと始まり、 シグナルペプチドの予測切断サイトは、ES^TERNとなっています。 この場合、 HisTagを HisTag-SDSPAGEとつなぐべきなのか？ SDSPAGEWES-HisTag-TERNとするべきなのか？ それとも、他に策があるのか、ということです。 A様の仰るのは、 !) PAGEWESTERNの部分をクローニングして、この部分にHisTagを付ける HisTag-PAGEWESTERN...というコンストラクトを作る ") Met..SDSPAGEWESTERN..を発現させ、(ブロックされないことを祈って)N末解析で、 実際のタンパクでの切断サイトを確認して(たとえば、SDSPAGEW^ESTERNだとすると) SDSPAGEW-ESTEXXHisTag-RNELIというコンストラクトをつくる ということでよろしいでしょうか？ !)はなかなかスムーズに行きそうですが… ")はちょっとコトですね。

(無題) 削除/引用 No.2014-4 - 2008/09/26 (金) 05:36:30 - おお HISは怖いかなと思う点があります。ERにタンパクが挿入される時、膜を貫通するヘリックス近傍がポジティブの電荷に富んでいると、そちら側がサイトゾル側に向くと考えられていますので。もしそのタンパクが膜タンパクの場合は膜貫通ドメインからなるべくはなすか、HISを細胞質側のループに挿入するのがいいかと思います(勿論機能面で必要がある時はそれを妨害しないという前提となりますが)。 分泌される場合は、N末切断部位から若干遠ざける方がいいのかなという気がします。 経験がないので、あまり強くは主張できないのですが、考えられることを書いてみました。 分泌、や膜タンパク用のN末(ATG)シグナルシーケンス-切断部位-tagといった感じのプラスミドを売っていると聞いたことがありましたが、そういうやつの方が安心かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2014-3 - 2008/09/25 (木) 21:10:04 - Tag >シグナルペプチドを２、３のオンラインサイトで予測しましたところ、 いずれのサイトでも、シグナルペプチドの切断サイトがドメインのN末側から６残基目にあり、どこにTagを挿入すればいいか、いささか困っております。 N-HisTag-<Chain 1>-S-S-<Chain 2>-myc-HisTag-C ちょっと複雑でうまく理解できているかわからないのですが、分泌されたあとの産物でしたら、 N-(SIGNAL)-HisTag-<Chain 1>-S-S-(SIGNAL)<Chain 2>-myc-HisTag-C という構成の遺伝子は N-HisTag-<Chain 1>-S-S-<Chain 2>-myc-HisTag-C となるのが一般的です。これで「普通は」問題ないはずです。mycとHisの抗体で検出できます。 もっともシンプルなのは、 N-(SIGNAL)-<Chain 1>-S-S-(SIGNAL)<Chain 2>-(myc-HisTag of vector) という構成でしょう。

(無題) 削除/引用 No.2014-2 - 2008/09/25 (木) 19:07:36 - A 各Chainの機能ドメインなどに関する情報はないのですか？もしそれが わかっているのであれば機能ドメインだけをクローニングしてそのN末に His-tagをつけるのも手かと思います。もちろんN末の機能ドメイン以外の 配列がフォールディングに重要な場合もありますから問題がでてくるかも しれません。どうしても全長をと言うことであればまずはN末His-tagの ないコンストラクションを作って発現、活性を確認したうえでそのN末の サイトを確認。その上で切断部位の直前にHis-tagを入れてさらにそのtagの 前に実際のシグナルペプチド+短い数残基を入れたコンストラクションを つくるぐらいでしょうか。N末のHis-tagは末端ではなく少し内側になり ますがシグナルが弱くなるものの市販のAnti-His抗体で認識できるはずです。実際に私はそのようなHis-tagを中央ににもった組み換えタンパク質を 作成し市販のC末Hisに対する抗体でWBしています。でもこの方法はかなりの 時間と手間がかかりますから、オンラインサイトで予想される切断部位を 信じて進めるのも手間も知れません。オンラインサイトによる予測はすで にわかっている複数のホモログとの比較で判断されているのであれば確か らしいかもしれません。もし新規なら私は手間のかかる方法をとりたいですね。

タグの挿入位置について 削除/引用 No.2014-1 - 2008/09/25 (木) 17:18:40 - EcoRI いつも大変お世話になっております。 クローニングした遺伝子を用いて、組換えタンパク質の発現を検討しております。 用いるベクターは pcDNA-mycHisです。 目的タンパク質は、vivoにおいて、活性化され、 以下のように、２つのポリペプチド鎖が、ジスルフィドで繋がれた形を取ることが予測されます。 N-<Chain 1>-S-S-<Chain 2>-C ですので、pcDNA由来のmycを利用しつつ、 以下のようにChain1のN末側にもうひとつHisTagをくっつけたコンストラクト作製し、 anti-HisTagとanti-mycを用いてwestern blotすることで、まずvitroで活性化することをみてみたいと考えています。 N-HisTag-<Chain 1>-S-S-<Chain 2>-myc-HisTag-C 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　<--pcDNA由来 シグナルペプチドを２、３のオンラインサイトで予測しましたところ、 いずれのサイトでも、シグナルペプチドの切断サイトがドメインのN末側から６残基目にあり、 どこにTagを挿入すればいいか、いささか困っております。 <ドメイン N-MXX..X-|-XXXXXX-|-X..XXXXXX-C シグナル> Chain1のC末側にタグをつけるのは、 ジスルフィドを形成するCysの相対的な位置を変えてしまうので、避けたいところです。 図が分かりにくいかと思いますが、皆様のお知恵を拝借したいと存じます。 よろしくお願い致します。

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