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(無題) 削除/引用 No.2009-5 - 2008/09/26 (金) 23:21:33 - yos ＞Aさん 　コメントどうもありがとうございます 今のところ、ハイドロキシアパタイトの素通りをパパインでFab化した後、ゲルろ過したものを結晶化に用いています

(無題) 削除/引用 No.2009-4 - 2008/09/26 (金) 23:15:48 - yos ＞EcoRIさん 　ご説明ありがとうございしました DEAEに吸着させて、1M NaClで落としては見たのですが、夾雑物が多かったので、現在は素通りを使っています もともとDEAEは血清添加培地に含まれるアルブミンやトランスフェリンを除く際には重宝していましたが、現在ハイブリドーマは無血清培地で培養しているので、このカラムで除ける夾雑物は実際にはそんなに多くないです

(無題) 削除/引用 No.2009-3 - 2008/09/25 (木) 19:59:35 - A モノクローナル抗体を使って膜たんぱく質の疎水的な部分を減らす 手法だと思うのですが過去に行われた論文ではその辺りに関して 記述されていないのですか？もしないのであれば過去に発表された 論文の著者にその辺りに関して聞いてみるのは手かもしれません。 たとえば京大の岩田先生がマックスプランクに留学されていた際に 結晶化した大腸菌のコンプレックスIVの結晶化でその方法が使われて いたように思います。 あとは少し手間ですがハイドロキシアパタイトカラムの素通りを使って モノクローナル抗体の結晶化を行ってその結晶を拾うことです。結晶化 条件は過去の論文から類推できると思いますし抗体はリジットな構造を もっていますから多少のコンタミがあっても結晶すると思います。

(無題) 削除/引用 No.2009-2 - 2008/09/25 (木) 18:45:36 - EcoRI >50mM Tris-HCl（pH7.5)に溶解し 陰イオン交換に付加する場合、 バッファーのpHは、8.0などアルカリ側に振ってやる必要があります こうすることで、おおよそタンパク質はDEAEに吸着します。 その後、0.5-1.0 M NaClまでグラジエントをかけてやれば、 大抵のタンパクは落ちて来ます。 で、溶出物をゲルろ過にかけて、挟雑物質を除くとともに、 任意のバッファーに置換します。

中性条件下でのモノクローナル抗体の精製 削除/引用 No.2009-1 - 2008/09/25 (木) 01:00:13 - yos 　膜タンパクの結晶化を行うために、膜タンパクに対するモクローナル抗体を作製しています 結晶化に用いる抗体はなるべく未変性で純度の高いものを目指しているのですが、現在以下の問題を抱えています Protein Gカラムを用いて、0.1M Glycine (pH2.5)で溶出した抗体は、酸で処理していない抗体と較べて、ELISAではかなりバックグランドが高くなったので、酸によって何らかの構造的変化がおきた可能性があります（溶出の際、チューブには2M Tris-HCl (pH9.5)を入れて中和しているのですが・・） 酸で処理していない抗体の精製は培養上清を50%硫安（粉末）で沈殿させ、50mM Tris-HCl（pH7.5)に溶解し、DEAEカラムにかけ、その素通りをハイドロキシアパタイトカラムにかけて100mMリン酸バッファー(pH7.5)で溶出していますが、eluteに抗体以外の多くの夾雑物が含まれていて困っています そのため現在はハイドロキシアパタイトカラムの素通りを使っています 別の方法として、抗体のサブクラスがIgG1だったので、ProteinAカラムにpH8.9で吸着させ、pH6.0で溶出する方法も試みましたが、もともと吸着が弱く収量が少ないのが難点です これ以外に中性条件下でのモノクローナル抗体を精製する方法をご存知でしたら教えて下さい また、私が今行っている精製方法についてもアドバイス頂けると助かります よろしくお願いします

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