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(無題) 削除/引用 No.2006-14 - 2009/02/02 (月) 10:04:34 - sin 先日、吸光計の異常によりMTTの値がおかしくなり、実験をやり直す羽目になりました・・。 光源の寿命などにもご注意ください。

(無題) 削除/引用 No.2006-13 - 2009/02/01 (日) 00:51:48 - genji 48穴使う理由は何ですか？ 最初から96穴使えば48穴から移す手間とブレを防げますよね。 （というか、48穴はプレートリーダーで読めないんですね） あと、イソプロ使う方法初めて知りました。 私はDMSO派です。 他は皆さんのサジェスチョンと同じです。

(無題) 削除/引用 No.2006-12 - 2009/02/01 (日) 00:17:40 - MTT MTTを溶液に溶かす際に ピペッティングだけでは溶けないと思います 超音波処理をし、完全に溶けたものを使用してはいかがでしょうか？ あとは洗浄に気をつけると。 まずは操作の手順を一度見直してみると 整理でき、うまくいかない理由も見えてくるかと思います。

(無題) 削除/引用 No.2006-11 - 2008/09/26 (金) 00:28:15 - +MTT　assay初心者+ >おおさん わかりました、ありがとうございました。 それらに注意しながらやってみます。

(無題) 削除/引用 No.2006-10 - 2008/09/25 (木) 20:50:31 - おお >[Re:8] +MTT　assay初心者+さんは書きました : > >おおさん > > 培地を除いたときに細胞がはがれてないかどうかの確認はしていますが > ホルマザンが溶けたかどうかの確認は顕微鏡で行っていませんでした。 > 溶けた場合、どのように見えるのでしょうか > 針状のものが残ってないかを確認すると言う事です。とけると針状の物はなくなり、結局は何も見えないと思います。 針状のものは明らかに細胞の数に伴って増えているようでしたら、そこに問題があるのではと思ったわけです。

(無題) 削除/引用 No.2006-9 - 2008/09/25 (木) 01:00:54 - +MTT　assay初心者+ ＞~ さん ありがとうございます。 はい、そのノックダウンはしていません。 ポジコンとして使える細胞があるので それを使ってまずやってみます。

(無題) 削除/引用 No.2006-8 - 2008/09/25 (木) 00:58:55 - +MTT　assay初心者+ >おおさん ありがとうございます。 そうです、接着細胞です。 色素の蓄積とは細胞からでる針状のものですよね。 それは確認しました。 培地を除いたときに細胞がはがれてないかどうかの確認はしていますが ホルマザンが溶けたかどうかの確認は顕微鏡で行っていませんでした。 溶けた場合、どのように見えるのでしょうか

(無題) 削除/引用 No.2006-7 - 2008/09/25 (木) 00:53:13 - MTT　assay初心者 ＞名無しさん ありがとうございます。 ごもっともです。まずassayの問題なのか細胞の問題なのかを はっきりさせるためにMTT assayがうまくいくことがわかっている 細胞を用いて同じ手技で測定すべきですね。

(無題) 削除/引用 No.2006-6 - 2008/09/24 (水) 21:21:49 - ~ Succinate-tetrazolium reductaseをノックダウンしていたりしませんよね。 MTTで測れる細胞をポジコンに置いていないことが、 試薬や操作と、細胞のどちらに問題があるのかが分からない原因ですよね。 ラボにHeLaなどは無いのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2006-5 - 2008/09/24 (水) 14:47:12 - おお 実験のプロセスに問題がななそうなら、MTTでははかれないと考えるのが妥当かと思います。 細胞は接着細胞ですよね。あとMTTを加える時の形態とか、インキュベーション後の色素の蓄積は確認されているでしょうか?この時点で、細胞数のわりに色素の蓄積が前日より少ないなら、細胞の生理的的な状態の変化で、細胞あたりの酵素活性が変化したと言ってもいいかもしれませんので、MTTはあきらめた方が賢明です。 反応後にバイチを除いた時に細胞がはがれてしまっていて、細胞とともに色素を捨ててしまった可能性とか、後は還元されたホルマザンは非常に溶けにくいので、完全に溶けてない可能せいなど(実際に溶けたか顕微鏡で確認してました)があるかもしれませんが、この辺は顕微鏡で各ステップチェックをしていれば気が付くはずです。

(無題) 削除/引用 No.2006-4 - 2008/09/24 (水) 13:33:51 - 名無し そうした問題はその細胞だけに起こるのでしょうか。それとも他の一般的な細胞でもおこっているのでしょうか。悩む前に、assayの技術的な問題のか、実験や細胞の特性に起因するのかをまず鑑別してみる事が必要とおもいます。MTT assayはミトコンドリアなどの酵素によるホルマザンの還元か何かで間接的に生きている細胞の数を見積もる方法だったように思います。だからそうした酵素群の活性や量の増減や、細胞の代謝状態の変化、処理がもたらすミトコンドリアへの影響などにより結果が左右されるように思います。そうした反応を阻害するようなファクターが細胞内外にあってもうまくいかないでしょう。もちろん細胞は増えていても死んでいたり、瀕死の状態であったなら、MTTではうまくいかないことはいうまでもありません。もしそう可能性が思い当たるようなら、別のより適切な方法、（色素排除法や直接カウントする方法）に切り替える必要があると思います。

(無題) 削除/引用 No.2006-3 - 2008/09/24 (水) 12:05:16 - MTT+assay初心者 >おおさん ありがとうございます。 すみません、肝心なことを書き忘れていました。 先日行なったMTT assayも上記のように、細胞が増えているにも関わらず、 測定値が前日に比べ上昇しないor減少するという結果になったのですが、 酸性イソプロピルアルコール液を加えた後の溶解液の色は、細胞数が少ない前日に比べ 明らかに薄かったです。 同じ酸性イソプロピルアルコール液を使って測定しています。

(無題) 削除/引用 No.2006-2 - 2008/09/24 (水) 10:56:19 - おお >[Re:1] MTT assay初心者さんは書きました : > 酸性イソプロピルアルコール液を100μl/wellに加え、２０回ピペッティングを行ない溶解した > 後、測定用の96well plateに溶解液を50μl/wellずつ移し測定を行なっています。 MTTの基本的な問題点はここでも何度か議論されていますので、検索されると言いいかとおもいます。極端にいうとこのあっせいは、細胞の数を図っているのではなく、細胞が持っている酵素の活性を測っています。 で48ウェルで100ulというのはちょっと少ないと思います。私は96ウェルで、MTT添加、反応後溶解液を加えて96ウェルに250ulくらいになるようにして測っていました。96ウェルで反応させた反応物を全部を250ulの溶液に溶かして、そもままプレートリーダーで測ったということです。ちょっとお示しになったプロトコールはそれに比べてずいぶん濃いと思います。もしかしたらプレートリーダーの上限から振り切れているところで測っているかもしれませんし、あまりにも濃くてうまく溶け切れてないかもしれません。

細胞が増えているにも関わらずMTT assayの測定値が上昇しません 削除/引用 No.2006-1 - 2008/09/24 (水) 10:41:30 - MTT assay初心者 私はshRNAiで、ある分子の発現をknock downした細胞における 増殖能の変化を現在MTT assayを用いて測定することを試みているのですが、 細胞数が明らかに増えているにも関わらず測定値が上昇しないor減少するということが 度々おこっていて原因が未だにわからず悩んでいます。 私は48well plateに細胞を10000cellsずつまき(1wellあたりのMediumは500μl)、 １日後、２日後、３日後にMTT溶液を50μl/wellに加え、６時間後、wellの中のMediumを抜き、 酸性イソプロピルアルコール液を100μl/wellに加え、２０回ピペッティングを行ない溶解した 後、測定用の96well plateに溶解液を50μl/wellずつ移し測定を行なっています。 考えられる要因として何があるでしょうか。 よろしくお願いします。

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