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ありがとうございます。 削除/引用 No.2003-4 - 2008/09/24 (水) 12:25:29 - あかね コメント有り難うございます。 なるほど、ゲノムDNAをBlockingに使うのですか。 試してみます。しかし500倍量となるとすごい量のDNAが必要ですね。 その他にBAC選択やブロッキングに関するご意見 宜しくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.2003-3 - 2008/09/24 (水) 09:41:21 - AP >ゲノムDNAを断片化して適当量、 Rocheのハンドブックによると、プローブより50倍過剰のSperm DNA, 50倍過剰のtRNAに加えて、500倍過剰のゲノムDNAを加えるとあります。

(無題) 削除/引用 No.2003-2 - 2008/09/24 (水) 09:35:07 - AP BACのように大きなサイズのクローンだとどうしても反復配列が含まれてしまいます。一つの方法としては、ユニークな配列部分をサブクローニングしてプローブにすることですね。 リピートを含むプローブでハイブリするとき、昔から良くやるのは、標的生物のゲノムDNAをキャリアーにする方法でしょう。リピート配列はユニークと比べると、Cot値が低いので速くハイブリッドを形成します。ゲノムDNAを断片化して適当量、ハイブリバッファーに加えれば、標的やプローブのリピートが優先的に二重鎖を形成してブロックされます。

DNA-FISH用のBACの選び方 削除/引用 No.2003-1 - 2008/09/24 (水) 09:07:36 - あかね 現在、DNA-FISHをBACを使って１コピーの遺伝子座の検出を試みていますが、Backgroundが高く、結果的にうまくいっていません。FISHに使用するBACの選び方があれば教えていただけないでしょうか？ 細胞はマウスの線維芽細胞 で、目的のDNA配列を含むBACをプローブと使っています。 BACをDIGまたはBiotinで標識（Nick translation）しプローブとして使用し、 蛍光標識した二時抗体あるいはストレプトアビジンで検出します。 １つの核に２つの蛍光スポットが検出されるのが理想的な結果なのですが、核全体が染色されスポット状の強いシグナルも検出されません。おそらくBACに含まれるリピート配列やノンスペシフィックなhybridizationを検出しているのではと思っています。現時点では、選択したBACがFISHに向いていないのでは？と疑っています。今回使用したBACはターゲット配列を含むクローンを「適当に」選びました。 そこでお聞きしたいのは、みなさんFISH用のBACを選択する際はなにか気をつけていることはありますか？それともどんなBACでもDNA-FISHに使用できるものでしょうか？経験等をお聞かせ下さい。 また、今回は選択したBACにイチャモンをつけているのですが、手技的な問題点があることも否定できません。そこで、今回のようなBackgroundを抑える方法をご存じの方いらっしゃいましたらご教授お願いいたします。 ちなみに、hybridization bufferの中にはsermon sperm DNA(ssDNA), tRNA, Cot1 DNAを加えています。それぞれ、プローブの10倍、10倍、５倍量を加えています。また、major satelliteのようなリピート配列をプローブとして用いた場合は、核全体が染まるのではなく目的の配列が再現良く検出できているので、FISHの系事態はそれほど間違ったプロトコルではないのだろうと思っています。このことは、上記のBackgroundが内在性のハプテンによるもので無いことも示唆しています。 アドバイス、ご意見等何でもかまいませんので、宜しくお願い致します。

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