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(無題) 削除/引用 No.2002-5 - 2008/09/26 (金) 00:58:44 - SphI >APさん、おおさん コメントありがとうございます。 自分が組み込んだインサートの中に一カ所、 vectorサイドのMCS以外の場所に一カ所の計二カ所のSphIがあるのですが、 vector側のSphIを認識しないようです。 人からもらったvectorなので、配列が違っていることもあり得ますよね。 他の制限酵素はすべた正しいパターンを示すので、このまま使ってみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.2002-4 - 2008/09/24 (水) 09:59:08 - AP 各社（NEBももちろん）の制限酵素カタログのAppendixなどに出ていることなので、それを読んで体系的に理解するのがよいと思います。 dam (DNA adenosine methlase)とdcm (DNA cytosine methlase)は大腸菌で増やしたDNAに起こる配列特異的メチル化で、damはgAtc、dcmはcCwggの大文字の塩基がもれなくメチル化されます。制限酵素の認識配列がメチル化配列をオーバーラップしている場合に切れなくなる酵素があります。Dam-やDcm-の宿主を使えばメチル化を回避できます。 CpGのメチル化は大腸菌ではなく、ほ乳類などで起こるメチル化なので、一旦、大腸菌で増やしたDNAなら関係ありません。一次クローニングの時に野生型の大腸菌では制限されて増殖しないので、特殊な遺伝子型の宿主を使わなければならないとか、ゲノムサザンなどで由来生物のゲノムDNAを直接消化する場合などに影響があります。 SphIの場合は、認識配列がdamやdcmのそれとオーバーラップしないので影響なし、CpGメチル化とはオーバーラップする可能性があるけれど、消化には影響しないです。 切れなかったのは、シークエンス情報が違っているのか、メチル化以外の選択性（周辺配列によって切れにくくなる酵素がある）のためではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2002-3 - 2008/09/24 (水) 09:43:11 - おお >[Re:1] SphIさんは書きました : > Not sensitive dam,dcm or mammalian CpG methylation. > とあります。これは、メチレーションがあってもちゃんと切れるという意味ですか？ ちゃんと切れます。SphIはメチレーションの有無にかかわらず、切れると思います。

(無題) 削除/引用 No.2002-2 - 2008/09/24 (水) 09:37:40 - おお http://www.neb.com/nebecomm/tech_reference/restriction_enzymes/dam_dcm_cpg_methylation.asp Please refer to the above URL. Plasmids from E.coli is generally methylated by the dam/dcm system. So you should be careful when you use dam/dcm methylation sensitive enzymes such as Xba I, Cla I, etc. CpG methylation is problematic when you use genomic DNA. In some species CG rich region in genomic DNA is partially but sometimes highly methylated especially mammals. You should not use CpG methylation sensitive enzymes for genomic southern blot analysis except for CpG methylation analysis when you use such species.

制限酵素とメチレーションの関係 削除/引用 No.2002-1 - 2008/09/24 (水) 08:43:15 - SphI 最近、切れるはずの場所で切れない酵素があったので、メチレーションのことで質問させてください。NEBのカタログの制限酵素の注意書きに Not sensitive dam,dcm or mammalian CpG methylation. とあります。これは、メチレーションがあってもちゃんと切れるという意味ですか？ 自分が使っているプラスミドにメチレーションがかかっているかどうかはどうやって調べるのですか？dam,dcmって何でしょうか？ 一つのプラスミドに同じサイトが二つあって、一方のみがメチレーションされていることもあるのでしょうか？ご教授お願いします。

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