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(無題) 削除/引用 No.1999-8 - 2008/09/26 (金) 01:16:34 - ＠ >[Re:7] おおさんは書きました : > ガラス同士ですりあわせるやつは、少し強すぎる可能性があります。 ホジナイザーはガラスではなく、先がテフロンでできているものを使用しています。 > あと、ホモジナイズ、遠心後に得られるペレットに核だけが回収されているか顕微鏡でチェックが必要だと思います。 顕微鏡でのチェックを行った事が無いのですが、染色などを行わないと素人目にはわかりづらいでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1999-7 - 2008/09/25 (木) 20:59:55 - おお >[Re:6] ＠さんは書きました : > そうですよね。実際やっている方法は > > 臓器に関してですが、ホモジナイズがしっかりされていれば問題は無いということなのでしょうか？ホモジナイズにはポッター型が使用しており、臓器片がみえなくなる10ストロークくらいでおこなっています。 > > ガラス同士ですりあわせるやつは、少し強すぎる可能性があります。 あと、ホモジナイズ、遠心後に得られるペレットに核だけが回収されているか顕微鏡でチェックが必要だと思います。細胞外由来者ののデブリスみたいな物も回収しているかもしれませんので。

(無題) 削除/引用 No.1999-6 - 2008/09/24 (水) 23:05:24 - ＠ そうですよね。実際やっている方法は 低張溶液でホモジナイズした後に10分ほど氷中で静置します。 　　　　　　　　　　　↓ 7000ｇで20分遠心分離した後に上清を採取して、その沈殿を抽出バッファーでピペッティングで懸濁させ30分氷中で静置します。 　　　　　　　　　　　↓ それを10000ｇで10分遠心したものの上清を核抽出画分としています。 核抽出画分はウエスタンブロットで核内に移行した転写制御因子の変化量をみたいと考えています。 Keon Wook Kangさんの2003年に発行された論文を参考にしました。 臓器に関してですが、ホモジナイズがしっかりされていれば問題は無いということなのでしょうか？ホモジナイズにはポッター型が使用しており、臓器片がみえなくなる10ストロークくらいでおこなっています。

(無題) 削除/引用 No.1999-5 - 2008/09/24 (水) 10:36:31 - おお >[Re:4] ＠さんは書きました : > 早速回答ありがとうございます。 > ホモジナイズした後は細胞と同様の操作で行えば良いでしょうか？ あなたの考えているプロトコールをもう少し具体的に提示した方がいいと思います。 低張な溶液でホモゲナイズした時はもうすでに細胞が壊れ核が出てきていると考えて、操作します。ですから細胞を集めた段階ではなく、次のステップに行っていると考えていいかと思います。 細胞と違うところは、細胞外のマトリクスなどのデブリスが核のフラクションと混ざることがありので、シュークロースを使ってより密度で厳密にフラクションを取った方がいい場合が多々あると思います。 > > ＞組織によって方法が違うので個別に論文を検索する必要があると思いますが、肝臓以外では純度の高い核を得るのは難しいかもしれません。 > > 肝臓の他に腎臓や小腸などでも行いたいと考えているのですが、臓器によって方法が違うのはなぜでしょうか？よろしければ教えてください。 腎は全く検討つきませんが、胃腸は非常に組織がしっかりしている(筋のような硬さがある)のでちょっと難しいいかもしれません。もしかしたらコラゲナーゼやトリプシンで消化して細胞を集めてからの方がいいかもしれません。組織によって違う一つの理由は、単純なホモゲナイズで細胞や核が組織の中から簡単に分離できるかで難しさが変わってくると思います。

(無題) 削除/引用 No.1999-4 - 2008/09/24 (水) 02:50:59 - ＠ 早速回答ありがとうございます。 ホモジナイズした後は細胞と同様の操作で行えば良いでしょうか？ ＞組織によって方法が違うので個別に論文を検索する必要があると思いますが、肝臓以外では純度の高い核を得るのは難しいかもしれません。 肝臓の他に腎臓や小腸などでも行いたいと考えているのですが、臓器によって方法が違うのはなぜでしょうか？よろしければ教えてください。

(無題) 削除/引用 No.1999-3 - 2008/09/23 (火) 06:25:38 - 回答 肝臓であれば『生物化学実験の手引き』とか『生化学実験講座』みたいな昔からある基礎的な実験書に詳細にでていると思います。組織によって方法が違うので個別に論文を検索する必要があると思いますが、肝臓以外では純度の高い核を得るのは難しいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1999-2 - 2008/09/23 (火) 01:45:51 - おお 特に柔らかい組織は低張溶液でマイルドにホモジナイズして核を集めると良いと思います。 硬い組織はそれなりの強いホモジナイズが必要がですが核も傷がつく可能性があります。

核抽出 削除/引用 No.1999-1 - 2008/09/23 (火) 01:19:33 - ＠ マウスの臓器からの核抽出をしたいと考えております。 培養細胞での核抽出は行った事があるのですが、臓器の場合ホモジネートしたものを細胞と見立ててよいのか、いくつか本を読んでみたのですがいまいちわかりません。ほぼ初心者に近いので一般的に行われていて、なるべく実験操作が簡易な方法を教えてください。 それとそれを参考にした文献について一言いただけると幸いです。

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