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アセトン沈殿でペレットが出来ず、液層が２層に分かれる。 トピック削除
No.1994-TOPIC - 2008/09/22 (月) 14:17:54 - アセトン沈殿
アセトン沈殿の際に遠心後、ペレットが出来ず、液層が２層に分かれた状態になります。
アセトン沈殿する際のバッファーの条件は3.5Mウレア、１Mチオウレア、40ｍMクエン酸、１％CHAPS、0.5M NaCl、50mM HEPES（pH8.0）です。
このサンプルに４倍量のアセトンを加え、室温で１時間放置し、その後、12000×ｇで５分遠心しています。この際にペレットができず、液層が２層に分かれ（おそらく下の液層がタンパク？）、非常に流動性があるために、サンプルが回収できない状態です。
バッファーの条件（HEPES、CHAPS)が悪いのでしょうか？
この現象の原因をご存知の方がいらっしゃれば、コメントをいただけないでしょうか？よろしくおねがいします。
　
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No.1994-7 - 2008/09/27 (土) 17:34:16 - アセトン沈殿
おお様、yt様、アドバイスありがとうございます。
TCA沈殿も試してみたいと思います。
yt様のご指摘で低温での沈殿効率がよいとありましたが、今回使用した実験でバッファーにウレアが含まれていますので、低温にすると析出するのではないかと懸念して、アセトン沈殿、メタノール／クロロフォルム法ともに室温での操作を行ないました。低温で操作し、ウレアなどを一度析出させ、その後、脱塩処理を行なってもよいと思ったのですが、操作をできるだけ簡単にしたかったため、今回は室温で操作しました。
低温での操作も試してみたいと思います。

(無題) 削除/引用
No.1994-6 - 2008/09/27 (土) 04:52:24 - yt
タンパクが沈殿しにくいのは冷却が不十分だからではないでしょうか？
ﾒﾀｸﾛ沈殿の経験しかありませんが、メタ・クロを加えた後に十分な時間ボルテクスしてその後4℃以下で15分以上冷やさないとタンパクの層が綺麗に出来ませんでした。
ﾒﾀｸﾛに関しては温度の記載がありませんが、プロトコール通りだと多分室温でされたと推測します。低温が何か不都合をもたらすのでなければ一度試しては如何でしょうか？

あと、遠心時間を10分くらいに延ばしても良いかと思います。

(無題) 削除/引用
No.1994-5 - 2008/09/26 (金) 14:34:38 - おお
2相に分かれる原因はわかりません、、、
有機溶媒は脂質など吸収します。デタージェントもそちら側に行く傾向があると思います。でも塩は物によりますが有機相に移ってくれないことがまあまああるのではと思っています。
あと使っているサンプルがタンパク以外何を持っているかというのもあると思います。糖類、多糖も有機溶媒側に移りにくいかもと思います。
あと似た方法でTCAで沈殿させるというのがあります。余裕があり、よく使う可能性があるなら収量とか比べてみて今後の方針を立てるのもいいかもしれません。

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No.1994-4 - 2008/09/25 (木) 02:07:43 - アセトン沈殿
おお様、名無し様、アドバイスありがとうございます。
メタノール/クロロフォルム法で行なったところ、完全には沈殿しなかった様子（上層が遠心後、上層が白くにごった状態）だったものの、アセトン沈殿に比べると、回収しやすかったです。SDS-PAGEの結果から、タンパクもロスがあったもののバンドが検出されました。
ただ、アセトン沈殿の際になぜペレットが出来なかったのかという疑問は残っております。名無し様の予測と同じく、変性剤や界面活性剤が阻害しているのではないかと考えております。
また、以前ソルビトールを含んだサンプルでもこのような現象が起こったので、含まれる物質によってタンパクの沈殿が阻害されるようです。

(無題) 削除/引用
No.1994-3 - 2008/09/23 (火) 22:18:28 - 名無し
界面活性剤やureaは蛋白質を可溶化する際に使いますから、蛋白質を沈殿させるときにこうしたものが高い濃度で含まれているのは都合が悪いのではないでしょうか。アセトンは４倍量しか入れてないので希釈後のこれらの最終濃度もそんなに下がっていないように思います。このバッファーでないと困るようならば、適当なbufferに透析してこうしたものを除いてからアセトン沈殿してもいいと思いますが、このとき大事な蛋白質が沈殿してロスしまうともともこうもないので注意が必要でしょう。アセトンをもっと10倍量以上とか入れて一晩フリーザーに置いてみるとかすればどうでしょうか。0.5M NaClが入っているので塩が沈殿するかもしれませんが,　その場合は90%エタノールなどで何回か洗うとかすれば塩はあるていど除けるようにも思います。

(無題) 削除/引用
No.1994-2 - 2008/09/22 (月) 15:04:30 - おお
メタノール/クロロフォルム法とか違う方法でやってみればと思うのですが、、、

http://www.healthsystem.virginia.edu/internet/biomolec/methanolchloroform.cfm

アセトン沈殿でペレットが出来ず、液層が２層に分かれる。 削除/引用
No.1994-1 - 2008/09/22 (月) 14:17:54 - アセトン沈殿
アセトン沈殿の際に遠心後、ペレットが出来ず、液層が２層に分かれた状態になります。
アセトン沈殿する際のバッファーの条件は3.5Mウレア、１Mチオウレア、40ｍMクエン酸、１％CHAPS、0.5M NaCl、50mM HEPES（pH8.0）です。
このサンプルに４倍量のアセトンを加え、室温で１時間放置し、その後、12000×ｇで５分遠心しています。この際にペレットができず、液層が２層に分かれ（おそらく下の液層がタンパク？）、非常に流動性があるために、サンプルが回収できない状態です。
バッファーの条件（HEPES、CHAPS)が悪いのでしょうか？
この現象の原因をご存知の方がいらっしゃれば、コメントをいただけないでしょうか？よろしくおねがいします。
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