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勉強不足 削除/引用 No.1993-13 - 2008/09/26 (金) 09:39:14 - TＸ ありがとうございました。 勉強させていただきました。

(無題) 削除/引用 No.1993-12 - 2008/09/25 (木) 22:26:18 - AP 私のアイデアでうまくいくかどうかは保証の限りではありませんが、 >3'-5'exo nuclease活性が低いKlenowで伸長反応後、切り出しKODplusでPCRという方法も使えないことはないかもしれませんが。Klenowを使ったことがないのでどこまで正確なものか。 たとえKODであろうと、Klenowのほうが桁違いに正確性が高いことをご存知ではない？　条件によってExo活性が優勢になったりpolymerase活性が優勢になったりしますが、とにかく合成は耐熱性polのどれより格段に正確なんですけれど。 また、校正活性のないTaqや、低い校正活性のExTaqやVentであっても、よほど長いDNAをPCRするとか、PCRを何度も繰り返すとかでなければ、すべてのクローンが何らかのmutationをもっているということは、ほとんどないものですよ。

(無題) 削除/引用 No.1993-11 - 2008/09/25 (木) 19:45:24 - TＸ > 後者は両端にミスマッチがあるので、校正活性の高い条件でなければ、 > P1-A-P2の構造はできないのでPCRで増えてくることはない。 > PCRする場合、校正活性に注意するほかに、伸長が最初のAの内部でとまった反応産物ができると、それが鋳型にアニールして伸長した時に、やはりP1-A-P2の構造ができる可能性があるので、伸長反応は十分に。 APさん わかりやすい説明ありがとうございます。 P1-A-P2がなぜ増えるかイメージがつかめました。 ただ今回は正確な増幅が必要な為、校正活性の高いKODplusを用いてPCRをかけています。 3'-5'exo nuclease活性が低いKlenowで伸長反応後、切り出しKODplusでPCRという方法も使えないことはないかもしれませんが。Klenowを使ったことがないのでどこまで正確なものか。

(無題) 削除/引用 No.1993-9 - 2008/09/25 (木) 15:17:00 - AP 検証してみましょう。 >A-linker-A取得を目論む。 >１）A−linkerの作製 >linkerの両端にそれぞれAの後部、前部を付加した後、 >頭に制限酵素サイトを付加したAとoverlap extension PCR。 >これにより制限酵素サイトI-A-linker-Aの前部を取得。 >2)A-linker-Aの作製 >１）と後に制限酵素サイトIIを付加したAとをprimerなしで2サイクルほどPCRしたの後、制限酵素サイトI,II特異的なprimerを添加しPCR。 >バンドはほとんどA、 最終的にPrimer I-A-Primer IIで増幅されているということですから、そういう構造ができているということですね。この実験デザインだと当然かと思います。 (1)で、A-L, L-A, P1-A（L: linker, P: 制限酵素サイトプライマー）が参加しているとすると、できるのはP1-A-Lか、P1/L-Aが優勢（/ mismatch) (2)でA-P2を加えると、P1-A-P2ができてP1とP2でPCRされる。 こういうことではないでしょうか。 私なら、 1) PCRで、P1-A-LとL-A-P2をつくる。 2) P1-A-LとL-A-P2をまぜて、primerなしで伸長反応。あるいはP1, P2を加えてPCR。鋳型のアニーリングの可能性は P1-A-L:L-A-P2と、P1/L-A:A-L/P2であり（: anneal, / mismatch) 前者は二量体を生じる。 後者は両端にミスマッチがあるので、校正活性の高い条件でなければ、 P1-A-P2の構造はできないのでPCRで増えてくることはない。 PCRする場合、校正活性に注意するほかに、伸長が最初のAの内部でとまった反応産物ができると、それが鋳型にアニールして伸長した時に、やはりP1-A-P2の構造ができる可能性があるので、伸長反応は十分に。 勘違いがあるかもしれませんが、いかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1993-7 - 2008/09/25 (木) 14:05:23 - TＸ APさんありがとうございます。 >[Re:5] APさんは書きました : > A+linkerという産物とAのみの産物がが出来ているなら、A+linkerをベクターにクローニングした後、linkerの後ろにAを入れれば手かずが少ないかなと思いますが。 仰せのとおりです。 ちょっと、PCR産物同士のライゲーションもどんなもんかなと思いまして。 先ほど過去トピをみたのですが、セルフライゲーションが起こり効率（収率）は悪そうですね。 > 当初の計画は、A+linkerとlinker+AのPCR産物を混合して、Aの両端プライマーでPCRをかけて、A+linker+Aという配列を取ろうとしていたということでしょうか。これだと単純にAのモノマーが増えるでしょうね。 当初の計画（誤った計画）は、A-linker-Aをベクターに組み込む為に A-linker-A取得を目論む。 １）A−linkerの作製 linkerの両端にそれぞれAの後部、前部を付加した後、 頭に制限酵素サイトを付加したAとoverlap extension PCR。 これにより制限酵素サイトI-A-linker-Aの前部を取得。 2)A-linker-Aの作製 １）と後に制限酵素サイトIIを付加したAとをprimerなしで2サイクルほどPCRしたの後、制限酵素サイトI,II特異的なprimerを添加しPCR。 バンドはほとんどA、目的のものと予想されるサイズのバンドを切り出し、 再度PCRかけたが、目的のものは増幅されず。 猛省。 > A+linkerとlinker+AのPCR産物を混合してプライマーなしでPCRをかけたらどうでしょうか。あるいは、denatureした混合物をKlenowなどで一回伸長反応だけするとか。プライマーを入れなければ増幅は起こらず、産物は最大でインプットした鋳型量を超えませんが、十分な量の鋳型をいれれば、ダウンストリームで使えるくらいの収量は得られるのではないでしょうか。 > 上の方法で上手くいっていないので、難しそうですね。

(無題) 削除/引用 No.1993-5 - 2008/09/25 (木) 10:58:27 - AP A+linkerという産物とAのみの産物がが出来ているなら、A+linkerをベクターにクローニングした後、linkerの後ろにAを入れれば手かずが少ないかなと思いますが。 当初の計画は、A+linkerとlinker+AのPCR産物を混合して、Aの両端プライマーでPCRをかけて、A+linker+Aという配列を取ろうとしていたということでしょうか。これだと単純にAのモノマーが増えるでしょうね。 A+linkerとlinker+AのPCR産物を混合してプライマーなしでPCRをかけたらどうでしょうか。あるいは、denatureした混合物をKlenowなどで一回伸長反応だけするとか。プライマーを入れなければ増幅は起こらず、産物は最大でインプットした鋳型量を超えませんが、十分な量の鋳型をいれれば、ダウンストリームで使えるくらいの収量は得られるのではないでしょうか。 今ではかなり長いDNAを合成機で作るのもまれではないですが、 長いDNA配列を合成オリゴから作る方法として、両端にオーバーラップを取って交互に相補鎖となるように合成した短いオリゴDNAまぜて、ギャップをKlenowで埋めるという方法があります。 ↓こんな感じで、一本鎖部分を酵素で合成して補います。 ---------==____________==---------==___________ この方法の応用ということです。

(無題) 削除/引用 No.1993-4 - 2008/09/25 (木) 10:03:57 - TX > または、一方のプライマーに例えばXbaI、他方にコンパティブルな酵素SpeIやNheIなどの認識配列タグをつけたプライマーを設計して、 > 両方のエンザイムで消化後、ライゲーションしもう一度両方の酵素できると、unidirectionalなフラグメントが残ると思います。 上記の方法で、unidirectionalなフラグメントが得られる割合はどの程度でしょうか？はじめに必要な制限酵素処理したPCR産物の量が検討つかないもので。

(無題) 削除/引用 No.1993-3 - 2008/09/22 (月) 17:52:42 - TX おおさん いつもありがとうございました。 参考にさせていただきます。 > 最初からとなると色々仕掛て工夫はできると思いますが、 最初から、linkerの両端に制限酵素部位を付加させて、 つないでいく方法が正攻法だったんですかね。

(無題) 削除/引用 No.1993-2 - 2008/09/22 (月) 14:16:11 - おお 最初からとなると色々仕掛て工夫はできると思いますが、現場ということであれば、そのA-linker、または元のAフラグメントとかを使って、半分をdATP存在下残りをdTTP存在下でTaqをつかいAまたはT付加をする。燐酸化のステップがどこかに必要ですが、T/Aでライゲーションが出来るので、コンカテマーが作れます。この場合は方向が定められません。 にた方法はBanIのような、不完全なパリンドロームを認識できるエンザイムを使って片側を3'GGCACC5'もう一方を3'GGTGCC5'のBanI認識配列を入れたPCRプライマーを作りコンカテマーを作るとunidirectionalなコンカテマーが作れると思います。 または、一方のプライマーに例えばXbaI、他方にコンパティブルな酵素SpeIやNheIなどの認識配列タグをつけたプライマーを設計して、 両方のエンザイムで消化後、ライゲーションしもう一度両方の酵素できると、unidirectionalなフラグメントが残ると思います。 地道にベクターにいれて、2段階でやってもいいと思いますよ。そんなに大変なことではないと思いますし、、、、

タンデムリピート 削除/引用 No.1993-1 - 2008/09/22 (月) 11:29:44 - TX Linkerを挟んでＡという遺伝子のタンデムリピート体を 作製したいと考えています。 Overlap extension PCRで作製しよう考え試みましたが Linkerの片方にＡという遺伝子1個を連結することはできましたが 、これらにもう1個のAという遺伝子を連結させようとしたら Aという遺伝子ししか増幅されませんでした。 （お恥ずかしい話ですが） よく考えてみると、linkerにのりしろをつけたとしても Ａという遺伝子同士ののりしろの方が大きい。 ということはこの方法では無理なのでしょうか？ これで無理なら、A-linkerに制限酵素サイトを付加しベクターに組み込んだ後、Linker側の制限酵素で切断する。この制限酵素断片と相補的な切断面を持つ制限酵素で処理したAを用いて、これらを連結させタンデムリピート体を作製しようと考えています。 なにかもっとスマートなアイディアがあればご教授ください。

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