インビトロジェンのゲートウェイを利用してBP反応を行っています。
BP反応プロダクトを泳動させると、pDONRやインサートのPCRプロダクトよりもかなり低いところにバンドが出ます。
ポジと思われるところにもバンドは見えるのですが、薄いです。
プロトコルに従い、続けて、OmniMax2-T1大腸菌で増やした後コロニーが生えました。ですが、4つのコロニーをミニプレップをし、電気泳動やシークエンスでも確認してもポジのものはなく、すべて上のかなり低いところのバンドの者と同じところにバンドが検出されます。
ゲートウェイのBP反応はほとんど偽クローンは生えないとのことなのですが、ドナーベクターに変なミックや、それがまたつながったりとかもしてこのような小さなバンドが出るのでしょうか？
反応条件はプロトコルどおりに50 fmol:50 fmol = PCR product:pDONRでおこなっております。PCRプロダクトもPEG沈殿をおこない、1バンドだけですのです。反応条件は3時間、18時間で試してみました。
よいアドバイスがいただけたら幸いです。
よろしくおねがいします。 |
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