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ありがとう御座います 削除/引用 No.1986-6 - 2008/09/22 (月) 21:59:47 - ハナ肇 使用しているベクターはpcDNA3なので、SV40を含んでいるようです。 http://www.molecularinfo.com/MTM/K/K2/K2-1/pcdna3.pdf このプラスミドで、293T細胞に、puromycinRを導入してチャレンジして みようと思います。 みなさん、どうもありがとうございます

(無題) 削除/引用 No.1986-5 - 2008/09/21 (日) 05:53:51 - おお すでに指摘がありますが、COSなどの細胞であればSV40oriの入ったプラスミドを使う方が有利だと思います。もしお使いのプラスミドがそうでなければ移しかえるのはてかもしれませんね。 あと詳細を調査した方がいいでしょうね。トランスフェクションの効率、や分泌の効率などです。分泌の効率は場合によってはcAMP(ジブチルcAMP)などの刺激で改善する可能性があります。

(無題) 削除/引用 No.1986-4 - 2008/09/20 (土) 14:57:25 - Caspase 293T細胞にSV40 oriの付いたコンストラクトとpuromycinRを導入。 puromycinで1週間選択後、バルクのまま無血清培養(CD293medium)。 2週間後の培養上清1Lからだいたい1mg程のFcタンパク質を得ています。 上記の導入細胞はpuromycin存在下でうえつぐ分には半年近く使っていても 産生能の低下は感じられません。 それと、お使いのFcはmouseとのことなのでproteinAよりはproteinGで精製する方が収量が上がるかもしれないですね。

(無題) 削除/引用 No.1986-3 - 2008/09/19 (金) 19:14:05 - 通りすがり こういう目的には、FreeStyle™ 293-F Cells （R790-07）という浮遊細胞系が良いという話は聞いたことがあります。自分ではやったこと無いのですが、どなたか経験者が居られれば、フォローお願いします。

(無題) 削除/引用 No.1986-2 - 2008/09/19 (金) 18:18:42 - りょう コンストラクトのプロモーターは高発現の物を使用されているでしょうからトランスフェクト以降の話になるでしょうか。 僕は293T細胞を使用していました。 Cosより皿面積あたりの細胞数が稼げる？気がしました。 トランスフェクトの効率も当然重要でしょう。 トランスフェクト後、最低72h待つ。その時点で一度上清回収して、新しい培地をその皿に入れて、さらに48-72h待って回収。 500mlから500microgramは取れた記憶があります。

Ig(Fc) fusion　タンパク作製のコツを教えて下さい。 削除/引用 No.1986-1 - 2008/09/19 (金) 17:53:57 - ハナ肇 FACS等で使用するためのFc fusionタンパクの作製を試みています。 マウスのIgGFcと融合させた、Fc fusion　タンパクを Cos7細胞で作らせたところ、 培養上清中に放出された量は0.1mcg/mL程度で、 ここから精製となると、 数mg得るには気が遠くなりそうです。 コンストラクトにおかしいからcosからの回収が悪いのか、 培養上清から得ようとするのがムリなのか？ いい方法、サジェスチョンがあれば教えて下さい。 よろしくお願いします。

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