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(無題) 削除/引用 No.1981-9 - 2008/09/23 (火) 17:27:14 - jnt 私の印象ですが、マイクロアレイで発現が半分になっている場合、RT-PCRで発現が2割減っていたらいいほうです。 同様のことは20回ぐらいやりましたが、RT-PCRでも発現低下を確認できる確率は50％程度です。

(無題) 削除/引用 No.1981-8 - 2008/09/20 (土) 09:57:51 - 7878 affy を使ってらっしゃるのですね。私が「解析方法に問題はないか」も視野にといったのは，バックグラウンドの処理方法やノーマライゼーションの方法，統計処理も含めて意図していたのですが，言葉足らずでした。β-actinがraw dataで1.3倍変化しているそうですが，アレイでこの差は有意な変化かどうか怪しいかなと。 あと，他の方も指摘されてますが，「RNAのクオリティの確認を」というのはrRNAの28Sと18Sを比較して分解していないかどうかチェックすると言うことです。260/280の吸光度比はRNAの純度は分かりますが，分解されているかどうかは分かりませんので注意が必要です。アレイでも重要なポイントですが，PCRでももちろん分解されているかどうかで結果が左右されますから，是非一度（ほんとはやる前に）確認されることをお薦めします。AgilentのbioanalyzerかBioRadのExperionがあれば楽に分かるのですが，なければちょっと量が必要だけど変性ゲルを使うことになります。これについては過去のスレッドも参考にどうぞ。 http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech/biotechforum.cgi?mode=view;Code=1532 私はスライドグラスのoligoカスタムアレイしか経験がなくて，おそらく実験方法から解析方法まで全く違うと思われますので，これ以上は何とも言えなくて申し訳ないですが。 上手く解決すると良いですね。

RNAの品質 削除/引用 No.1981-7 - 2008/09/19 (金) 17:49:45 - ema ＞アフィメトリクス社のHuman U133 Plus 2.0 ＞260/280がどれも1.9-2.0の範囲であることは確認したのですが、ゲルに流すなどの方法で確認していません Affyのプロトコールで必ず分解率を見るように、、、ってでてませんでした？260/280だとRNAが有るのがわかっても、分解してていも数値がでるので。 ゲルだと量がいるのでAgilentBioanalyzer2100で。これでRIN7くらいならいいですが低ければ×。 ＞P<0.01 はSignal数値のP-valueでしょうか、Change P-Valueでしょうか？ またAffyならGCOSでみると各プローブのハイブリ状況がみえます。12個くらい設計されてますが、それでPrimer位置のものがまずいハイブリのデータだとするとPCRのデータとアレイのデータはそんなに一致しないことがあります。 このときはPCRの方をどっちかというと信じて実験してます。 >アレイの結果から発現量の変化の少ない都合の良い遺伝子を見つけ出して勝手にそれをコントロール InternalControlはほんとは動くものなので、AffyのアレイのReportファイルをみると５種類くらいGAPDHとかのinternalが乗ってますが、これでまあまあのものを決めてしまうか、PCRのなら各メーカがcontrol primerはいろいろ出してるので、動かないもの選択して決めてしまうかです。

マイクロアレイの結果の検証 削除/引用 No.1981-6 - 2008/09/19 (金) 15:49:20 - ぱんだ ご助言ありがとうございます。 使用したアレイはアフィメトリクス社のHuman U133 Plus 2.0ですので１カラーです。 ＞7878様 まずマイクロアレイに用いたRNAのクオリティは細胞から回収した時に吸光度の260/280がどれも1.9-2.0の範囲であることは確認したのですが、ゲルに流すなどの方法で確認していません。 また、統計の方はおそらく間違っていないと思いますが、詳しくないのであまりよく分かりません。 ＞めいめい様 ターゲット遺伝子はマイクロアレイのRaw Dataのシグナル、ｑRT-PCRのCt値を見てもそれほど発現量は低くないと思います。 ＞おお様、めいめい様 しかしアレイのRaw Dataを見るとｑRT-PCRでインターナルコントロールとして用いたβ−アクチンの値がノックダウンによって１．３倍程度に上昇しているようでした。GAPDHも同様に上昇しておりこれら以外のインターナルコントロールを見つけた方が良いようです。 こういった場合はアレイの結果から発現量の変化の少ない都合の良い遺伝子を見つけ出して勝手にそれをコントロールにしてしまっていいのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1981-5 - 2008/09/19 (金) 07:09:06 - おお siRNAノックダウンと言う事ですが、転写因子ならまだしも、物によっては結構工夫が必要かもしれません。ノックダウンがどの程度効いているか、妥当なタイムポイントはいつか(ノックダウンの効率だけじゃなくアウトプットの形質などを考慮にいれて)などいろいろと決めないといけないことがあるかなぁと漠然と思います。 なるべく差を大きく取るために、ノックダウンと過剰発現(強制発現)で取るともう少しクリアーにデーターが取れるかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.1981-4 - 2008/09/19 (金) 06:38:20 - めいめい ターゲットとしている遺伝子は、その細胞の中である程度内在性の発現レベルがあるものなのでしょうか？ものすごく初歩的なポイントとして、アレーのデータ解析の際、せめて、めぼしい遺伝子だけでも、全自動的に計算された数字の相対変化だけ追いかけずに、生データ（絶対値）の変化も念のため確認する方が無難かと思われます。 もし他の方のアドバイスの通りに実験系をたてて、問題が解決されない場合、全く同じRNAサンプルからアレーとPCRをかけて確認するのも考慮しなければならないかもしれません。ただ、コストも 手間もかかるでしょうが、、

(無題) 削除/引用 No.1981-3 - 2008/09/19 (金) 06:10:15 - おお 2倍はたしかに微妙なところかもしれません。2カラーでやってますか?それとも1カラーですか? 指摘がありますようにアレー(もちろんPCRも)に使ったRNAのクオリティーは大きく結果に影響します。臨床で得られるサンプルはなかなか評価に耐えうる物がないのでアレーにのせても無駄と判断するラボもあります。 もう一つはインターナルコントロールの問題があると思います。アレーはグローバルスタンダダイゼーションで比較すると思いますが、RTPCRは特定の遺伝子ですよね。 アレーのデーターをみて使ったインターナルコントロールが動いてないか確認してみるのも必要かもしれません。あるいはアレーで動いてないものをひろいそれを基準にしてみるとか。

(無題) 削除/引用 No.1981-2 - 2008/09/19 (金) 02:13:50 - 7878 マイクロアレイの結果をPCRで確認するのは、適切に実験がなされていれば問題なくできると思います。経験上だいたい７、８割でマッチすることが多いです。 役に立つかわかりませんが、思いついたことを挙げてみます。 １．RNAのクオリティ（28S/18S ratioが2.0が理想）が悪いとアレイそのものの信頼性が損なわれます。バイオアナライザーかゲルで確認はされましたか？ ２．データの解析方法に問題はないか。統計の専門家ではないので具体的なことはいえないのですが、解析方法が適切だったかどうかも検証されては。 ３．アレイで使ったRNAでもPCRで検証してみては。 ほかに詳しい方のレスがつくといいですね。

マイクロアレイの結果の検証 削除/引用 No.1981-1 - 2008/09/18 (木) 19:17:30 - ぱんだ 現在　ある蛋白質のsiRNAによるノックダウンによって発現が変化する遺伝子の探索をマイクロアレイを用いて解析しております。マイクロアレイは異なる日に調製したRNAに対して3回行い、再現性良く変動している遺伝子をピックアップしました。 ここまでは良かったのですが、そのピックアップした遺伝子の発現変化をqRT-PCRによって確認しようと試みたのですが、とりあえず試してみた4つの遺伝子すべてにおいてマイクロアレイで観察された結果とは異なる結果になってしまいました。 マイクロアレイの結果からP<0.01で遺伝子をピックアップしており、コントロールの発現量に対して二倍ぐらい発現が変化しています。ｑRT-PCRは異なる日にマイクロアレイの時と同様に処理した細胞の RNAに対して2回を行いました。qRT-PCR自体の再現性は良いですが、得られた結果はマイクロアレイのものと矛盾しており、マイクロアレイでは発現の減少が見られるのに対しｑRT-PCRでは逆に上昇していたり、まったく変化していなかったりします。 マイクロアレイの実験はうちの研究室では始めてやりますのでマイクロアレイでピックアップした遺伝子の中からどの程度の確率でqRT-PCRでも同様の結果が得られる遺伝子が取れるのか分かりません。 マイクロアレイの結果をｑRT-PCRで確認するのは難しいことなのでしょうか？

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