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(無題) 削除/引用 No.1965-15 - 2008/09/17 (水) 00:05:50 - さあ〜ん 9cm X 9cm膜をハイブリバックに入れて サア〜ン　ml ECL混液は膜の上に覆えばOKということで2.5ml

抗体液量について 削除/引用 No.1965-14 - 2008/09/16 (火) 23:52:35 - TS トピ主さんの質問に含まれておりましたが、他の研究室がどの程度でやっているのか、確かに気になるところです。 当方、ミニゲルをルーチンで使用しております。転写後にメンブレンを短冊状に切ることが多いですが、その大きさによって以下のような感覚です。ちなみに、振とう時は、メンブレンのサイズに合わせて作った、パラフィルム製の船を使用しています。 9x7 cm :10 mL 9x3 cm :5 mL 9x1.5 cm :3 mL 個人的には、若干贅沢に使用しているかな、と思ってはいます。メンブレンがどっぷりと浸かっている状態が安心で好きです。

(無題) 削除/引用 No.1965-13 - 2008/09/16 (火) 23:02:35 - AP >研究室で教わった方法では、メンブレンをカクシャーレにおいて、 >抗体液を節約するために、少ない液量で反応させているために、 液量が少ないと特に、メンブレンが最初コンタクトした部分が、抗体液を一気に吸収・吸着してしまって、あとでいくら撹拌しても均一にならず、濃いところはいつまでも濃く、薄いところはずっと薄いままになることがあります。 メンブレンを平たく置いて上から抗体液をかけ、あとから全体に行き渡らせているようなやり方だと、最初に抗体液が乗ったところが濃くなります。 先に抗体液を置いて、メンブレンをかぶせる場合も、場所によって時間差が出来ないようにコンタクトさせるように注意します。

(無題) 削除/引用 No.1965-10 - 2008/09/16 (火) 22:31:21 - student 以前にも議論されておりますよ http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi?start=1;mode=view;Code=1369 もしくは washするときに一つのタッパーに数枚のメンブレンは入れていないですよね？ 私の経験ではメンブレン同士のこすれ合いがムラになります。

(無題) 削除/引用 No.1965-9 - 2008/09/16 (火) 21:02:55 - うーん メタノールをどこかECLの直前で使用していませんか？ ECLとメタノールの相性は悪いです。

(無題) 削除/引用 No.1965-8 - 2008/09/16 (火) 20:54:15 - WBWB たくさんのアドバイスを頂戴致しましてありがとうございます。 まず、フィルムの感光していて黒くなった経験がありますがそれとは異なります。 発色液をかけてからは、しっかり水分をきって、 クリアファイルにはさんだ後、厚紙に貼り付けて現像しています。 出てくる黒い影は、焼き直しても同様に次のフィルムにも 確認できるので　発色液のよどみではないと考えておりました。 黒く影のでたメンブランを取り出して洗浄し、 再度、発色させてもその影は消えませんでした。 ですので、抗体液由来の不手際かと考えている状況です。 研究室で教わった方法では、メンブレンをカクシャーレにおいて、 抗体液を節約するために、少ない液量で反応させているために、 机の歪みなどでおきる、液の不均一が原因なのではと思うのですが。 頻繁に溶液を動かしながら反応させても 影が見られるときはでてしまいますし、 放置したままでもきれいにいくときはあるので なんとも言い難いのですが・・・。 皆さんはどれくらいの抗体液量を用いていらっしゃいますでしょうか。

よどみの解消 削除/引用 No.1965-7 - 2008/09/16 (火) 16:55:38 - Acena+Demina よどみを解消するには、発色液をかけた後、一分ぐらいでメンブランを濾紙の上において、上から更に濾紙をかぶせて挟みます。こすって発色液を完全に除去した後、ラップに包んで現像してみてください。きっと解決すると思います。発色液で塗れたまま、（ひどい場合、発色液に泳がせるくらいドボドボにしたまま）ラップしてしまうと「よどんで」しまい、かえってシグナルを拾えなくなります。更に注意したいのは、HRPのセカンド抗体溶液をピンセットに付着させたまま、現像前のメンブランにさわっていませんか？これをやると真っ黒の線が入ったりします。

(無題) 削除/引用 No.1965-6 - 2008/09/16 (火) 14:02:55 - おお 私も、反応溶液が過剰ぎみなのかと思います。AP様が書いているように、余分な溶液を除くことが大事ですが、得られるシグナル(目的のバンド)がしっかりしているなら、若干2次抗体を減らしてもいいかもしれません。この場合だとメンブレンのバックグランドがあがり、周りにそれが広がっているようにみえます。たまにラップのしわに溶液がたまってたりして、そういうのがイメージに反映されたりします。 あとはフイルムが感光しているといった類のトラブルの可能性は? フィルムが感光しているとすればメンブレンの位置とは関係なく、うっすら黒くなったり、その黒くなり具合にグラジェントがかかったようになったりとかです。いつも同じようなパターンで黒くなるなら箱のフィルム全体が感光している可能性が高いですし(縁が真っ黒になっていることもよくあります)、毎回違うなら暗室で光が漏れているとか、時計など暗いところで見えるように蛍光塗料を塗ってある所からの光がフィルムに影響与えてるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1965-5 - 2008/09/16 (火) 13:40:22 - AP >溶液のよどみのような影なのですが、 基質液が多すぎる状態で、exposureするとそうなることがあります。 発光中の反応産物が拡散することによって起こります。 ラップをかける前に、メンブレンからよく基質液をきるといいです。 反応産物の拡散が特に気になる場合は、基質液で湿らせたろ紙の上に、 洗浄後、水気をきったメンブレンをブロット面が上になるように乗せた状態で ラップすることもあります。

(無題) 削除/引用 No.1965-4 - 2008/09/16 (火) 12:40:12 - ~ よどみはメンブレンを当てたところだけですか？ それとも、フィルム全体ですか？ ●メンブレンのみ ECLで濡れたメンブレンはどのようにしてフィルムに焼いているのですか？ 連続で2回フィルムに焼いた場合、同じよどみになるのですか？ 一度焼いた後で、ECLに付け直してから焼いた場合、同じよどみになるのですか？ 同じメンブレンを異なる抗体で反応させた場合、同じよどみになるのですか？ ●フィルム全体 試薬を全部交換しても変わらないのですか？ 別の現像機で試した場合はよどみが出るのですか？ 元のフィルムが感光しているのであれば、新しいフィルムを使えば改善すると思いますが、試しましたか？

(無題) 削除/引用 No.1965-3 - 2008/09/16 (火) 12:35:11 - うーん メタノールをどこかでつかっていますか？ たとえばピンセットをあらったりしたときに…

(無題) 削除/引用 No.1965-2 - 2008/09/16 (火) 11:57:55 - 雑兵 現像液がへたってるのでは？

ECL検出での黒い影 削除/引用 No.1965-1 - 2008/09/16 (火) 11:55:00 - WBWB 最近　WBの検出をECLで行うと、かなりの確率で現像結果に 黒い影が出てきてしまうようになりました。 溶液のよどみのような影なのですが、 膜の乾燥や溶液の不均衡などもと考えてはいたのですが、 いろいろ試しても　原因が明確に分からないので ご経験のある方がいらっしゃいましたら ご助言よろしくお願いいたします。

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