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(無題) 削除/引用 No.1956-6 - 2008/09/15 (月) 21:30:24 - A この論文で似たようなことやってます。 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11389169?ordinalpos=2&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DefaultReportPanel.Pubmed_RVDocSum

Re: 削除/引用 No.1956-5 - 2008/09/15 (月) 19:29:22 - UC こんにちは。 見たい遺伝子が、その系では非常にリッチなので、プライマーも消費してしまってるとか（まぁ、普通はプライマーは過剰量入っているものですが）。一度、一番薄いテンプレート濃度の更に1/1000, 1/100薄い濃度でどうなるか見てみては如何でしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1956-4 - 2008/09/14 (日) 16:30:29 - たろ ＜ami様 β-actinや36B4などの内部標準をはじめ、他の遺伝子では濃度依存性は保たれているため、templeteは大丈夫だと考えています。 また、内部標準のバンド強度と比較しても、目的遺伝子の発現を見ている際のバンド強度が明らかに低いレベルで飽和に達してしまっています。 やはり、primerが悪いのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1956-3 - 2008/09/14 (日) 15:48:59 - ami > 最近新しいprimerを注文したので、同じ鋳型の濃度勾配を作製し、PCRを行い、アガロース電気泳動を行いましたが、濃度勾配通りにバンド強度が増加しません。むしろ、Templete量を増やすと、バンド強度が減少する傾向にあるほどです。 β-actinなどはどうですか。勾配どおりになりますか。 鋳型がきれいでない可能性はどうですか。EtOH沈殿してみるなど。

(無題) 削除/引用 No.1956-2 - 2008/09/14 (日) 15:47:36 - おお きっと増幅効率が飽和してしまってから見ているのではないでしょうか。飽和した時のシグナルは量と相関性がないことがあります。リアルタイムでやるか、そのたのPCRの半定量用の方法を取り入れた方がいいかもしれません。エチブロで見れるぐらい増幅してしまうともう飽和する域に達していることがたいていです。 あるいはあなたのテンプレートになにかエタノールとかPCRを阻害するものが入っていて、高濃度のテンプレートで阻害がかかっているかもしれません。

RT-PCRによるmRNA発現量の測定がうまくいきません 削除/引用 No.1956-1 - 2008/09/14 (日) 15:11:16 - たろ いつもお世話になっております。 当方、逆転写酵素とTAKARA ExTaqを用いてRT-PCRを行い、mRNAの発現量を解析しています。 最近新しいprimerを注文したので、同じ鋳型の濃度勾配を作製し、PCRを行い、アガロース電気泳動を行いましたが、濃度勾配通りにバンド強度が増加しません。むしろ、Templete量を増やすと、バンド強度が減少する傾向にあるほどです。 改善策として、別のDNA polymeraseも試してみましたが、同じでした。 他にもTm値を変更したり、primerを設計し直したり等の策を考えていますが、どのようにして行うのが一番良いのでしょうか。 よろしくお願いします。

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