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(無題) 削除/引用 No.1955-16 - 2008/09/16 (火) 00:50:51 - めいめい 大腸菌でのリコンビナントの発現誘導はそれほど困難ではなく、精製蛋白をCBBで見る限り誘導はきちんと行われています。血清中で目的蛋白の定量を目標としております。その場合は、血清を抗原としてELISAでスクリーニングすのでよろしいのでしょうか？ 私が一番不思議なのは、ほとんどのクローンでこの（非特異的？）バンドが見えている点です。奇妙な言い方ですが、もし仮にこのバンドを認識するクローンだったとして、こんなに効率よくウエスタンに利用できるクローンばかり得られるものなのでしょうか？ですから、未だにウエスタン検出での何かシステミックなエラーの可能性も考えてしまいます。

(無題) 削除/引用 No.1955-15 - 2008/09/15 (月) 15:27:34 - 染めQ 抗原は大腸菌リコンビナントでも良いと思いますが、 ELISAで使いたいのならスクリーニングには実際に測るであろうサンプルを用いてやる方が良いでしょう。 抗原として用いた大腸菌リコンビナントタンパク以外には手持ちがないのでしょうか？その大腸菌リコンビナントタンパクは可溶化状態である程度精製してありますか？ 往々にしてあるのは大腸菌での発現が低く、また精製でもあまり純度が上がらず、時間がないのでそれを打ってしまって、とれたクローンがモノ以外を認識するものばかり。これだと目的のクローンをとるのにかなり苦労します。というか良いクローンにめぐり合う頻度はグッと落ちます。 発現が難しくないものなら293やCHOに入れてtransientに発現させた培養上清（勝手に分泌タンパクと仮定していますが、、、）を用いてやると良いと思います。 細胞内タンパクであってもどのみちある条件で可溶化して測定するのでしょうから、それと同じ条件でスクリーニングすれば「あなたの目的に使える」抗体が得られるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1955-14 - 2008/09/15 (月) 02:12:52 - めいめい 本当に皆様のご意見ありがとうございます。CBBでは予想される所にきちんと検出されており、ポリクロを用いてそれが目的のものであるかどうかも確認はしています。ですから、抗原に目的のものが含まれていない（あるいはものすごくその割合が少ない）という可能性はないです。頭を悩ませるもう一つのポイントはスクリーニングしているクローンで、薄いのですが目的の高さ付近にバンドが見えているものがあるのです。結局は免沈するしかないとは思うのですが。。

(無題) 削除/引用 No.1955-12 - 2008/09/15 (月) 00:53:45 - りょう 予想される所にはwestern signal無しということなので、捨てでしょう（CBBなどでは抗原は、予想される所にmajor bandとして観察できるのですよね？）。 細かいことを言うと、現時点ではそのクローンも完全に否定はできません。というのは、そのクローンは生の状態（ELISAなど）では本物に対して反応しているけど、変性条件では本物には反応しないクローンであり、25kDaのものにクロスリアクトしている可能性があるから。 なので先ほどコメントしたように銅羅 さんのアイデアで確認するのが先決かも。 一応コメントしておきますが、モノクロ(あるエピトープ1種に対する抗体）でもクロスリアクトで複数の蛋白を認識することはよくあります。 あと、SDS-PAGEの場合、目的蛋白より低分子の位置にバンドが出た場合、目的蛋白の分解産物の可能性も考えられます。今回の場合は目的サイズの所にwestern signalが出ないということなので、この可能性はないです。

(無題) 削除/引用 No.1955-11 - 2008/09/15 (月) 00:37:25 - めいめい りょうさんご親切なご回答ありがとうございます。ご指摘の通り、IPは必須であると考えております。具体的には、どのような免疫沈降を行うのがよろしいのでしょうか？（参考となるHPなどありましたら教えて頂ければ助かります）。あとこの非特異的バンドを認識しまっているクローンが目的の蛋白を認識する可能性はないのですよね？（そのためのモノクロでしょうから。。）

(無題) 削除/引用 No.1955-10 - 2008/09/15 (月) 00:36:54 - りょう >[Re:2] 銅羅さんは書きました : > 目的タンパク質を発現させていない大腸菌をコントロールとされてはいかがでしょうか。 読み直すと銅羅さんの意見が一番シンプルで良いですね。 この時、精製せずにtotal lysateをELISA plateに貼り付けて行うとベターかなあと思います。発現量・抗体力価によっては検出限界以下になる可能性も否めませんが。

(無題) 削除/引用 No.1955-9 - 2008/09/14 (日) 23:55:29 - りょう リコンビナント蛋白とは大腸菌に作らせた物でしょうか？ 精製時に混入した目的抗原以外の蛋白に対する抗体なら、同じ精製物をELISAの抗原に使用している現段階では、本物の抗体なのかどうかの判別が難しいですね。 抗原部分を前半と後半に分断して、新たな2コンストラクトを作成し、同様に大腸菌から精製して、どちらか一方で陽性、他方で完全に陰性になれば、より本物らしい感じになりますが、それでも前半分に特異的に結合・コンタミしてくる大腸菌由来蛋白が無いとは言えないですが・・・。 哺乳細胞での共発現蛋白とその陰性コントロールをELISA plateに貼り付けて、反応性を見るのは？抗原量が極端に少なくなるので感度的に厳しいかもしれませんが、特異性を言うには良いかも。 他に思いつくことは、ELISAの生蛋白に反応しているならIP能があるかもしれません。リコンビナント蛋白をIPして特異的に目的蛋白だけ落とせるかどうかを指標にする。

追加です。 削除/引用 No.1955-8 - 2008/09/14 (日) 20:58:41 - めいめい 例えば、スクリーニング事態を止めてしまったほうが懸命なのでしょうか？それとも、ウエスタンの結果が出ているクローンだけ捨てて、希望を持ってスクリーニングを継続していいものなのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1955-7 - 2008/09/14 (日) 20:52:12 - めいめい みなさんありがとうございます。ELISAで抗原として用いているものと、ウエスタンで使用したものは基本的に同じものです。私が悩ませているのは、このモノクロの一番の使用目的がELISAにあることなのです（ウエスタンでもできれば検出したいですが）。ですから、ELISAでポジと出たものが、本当に目的の蛋白を認識した結果ポジとなっているかどうかを確認したいのです。皆様のご意見をお願いします。

(無題) 削除/引用 No.1955-6 - 2008/09/14 (日) 18:43:43 - りょう westernのサンプルとして泳動されているサンプルはELISAで使用されている物と同じでしょうか？ そうだとしたら、エピトープが全く別の抗原由来のものであるか、あるいは、求めている抗原に対するものであるが還元状態でのSDS-PAGEには使用できない抗体ということで、僕なら現実的には捨てる方向に進みます。 しかし、westernに用いてるサンプルが他の物なら話は違ってきますが(返答待ちます）。

(無題) 削除/引用 No.1955-5 - 2008/09/14 (日) 17:59:06 - おお >[Re:4] めいめいさんは書きました : > このウエスタンで検出されたノスンペ（？）の認識でELISAでもポジとなっているということなのでしょうか？ おそらくそういうことだと思います。 > ELISAポジで、ウエスタンもポジのようなクローンを拾える確率はやはりそうとう低いものなのでしょうか？ この辺は運じゃないかなとおもいます。抗原によるでしょうし。実際やったことはないですが、相当な数スクリーニングする事もあるようですから、、、経験者のコメントが欲しいところですね。

さらに質問 削除/引用 No.1955-4 - 2008/09/14 (日) 06:10:35 - めいめい こういったプラクティカルな内容に応えて頂きありがとうございます。 私は基本知識が不足しているのかもしれませんが、更に質問が有ります。 今ウエスタンでスクリーンングしているクローンは、ELISAでポジとなったクローンを拾って行っています。つまり、このウエスタンで検出されたノスンペ（？）の認識でELISAでもポジとなっているということなのでしょうか？このまま、ウエスタンか免疫沈降でスクリーニングを続けようとは思うのですが。あと、とりとめのない質問ですが、一般的（経験的に）、ELISAポジで、ウエスタンもポジのようなクローンを拾える確率はやはりそうとう低いものなのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1955-3 - 2008/09/14 (日) 03:37:19 - おお >[Re:1] めいめいさんは書きました : > 目的と異なる抗原を認識する抗体が産生されてしまっていることを意味するのでしょうか？（抗原は大腸菌で発現させて精製しているので、多少は交雑物は入る可能性はあります）。 多分そうだと思います。それらのクローンは目的にタンパクを認識しないネガティブなクローンなので細かいことは置いといてスルーしていいかと思います。

ネガコン 削除/引用 No.1955-2 - 2008/09/14 (日) 02:27:52 - 銅羅 目的タンパク質を発現させていない大腸菌をコントロールとされてはいかがでしょうか。

モノクローナル抗体 削除/引用 No.1955-1 - 2008/09/14 (日) 01:19:31 - めいめい 現在、モノクローナル抗体を作成中のものです。経験がおありの方のご意見を頂戴したいと思います。リコンピナント蛋白を抗原として出発し、現在ハイブリドーマをスクリーニング中なのです。 還元条件下でウエスタンを行ったところ、いくつかのクローンで、予想されないサイズ（25kD）に強いバンドが検出されています（予想されるところにはなし）。IPではないので、IgG-L鎖を認識しているとは考えにくいのですが、これは、目的と異なる抗原を認識する抗体が産生されてしまっていることを意味するのでしょうか？（抗原は大腸菌で発現させて精製しているので、多少は交雑物は入る可能性はあります）。

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