全16件 ( 1 〜 16 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

DMSOの添加方法 削除/引用 No.1954-16 - 2008/09/29 (月) 14:22:27 - mom-a http://cellbank.nibio.go.jp/indexpractice.htm 上記JCRBセルバンクのサイトから細胞培養の準備⇒参考資料：簡易凍結法と進んでいくと、凍結時のDMSOの加え方について2通り（細胞浮遊液を氷冷し、撹はんしながら加える方法と、予めDMSO添加培地を作って氷冷しておいたものを集めた細胞ペレットに加えて細胞を懸濁する方法）出ています。 いずれも、DMSO混合時の発熱を抑えることをポイントにしているようです。10%DMSO入り培地を添加して5%にしているのなら、発熱するというほどのこともなさそうですが、何かの参考になれば。

(無題) 削除/引用 No.1954-15 - 2008/09/27 (土) 21:18:57 - ami 何かコンタミしてるとか･･･（汗

[ここまでの戦況−後半] 削除/引用 No.1954-14 - 2008/09/18 (木) 21:20:26 - ami ○ 細胞を回収する数時間前にバイチを更新する。 だめでした。 ○ DMSOによる急激な浸透圧ショックが原因かもしれませんね。 ゆっくりと10%DMSOを加えていき5%にしてみました。結果は見ているところです。 ○ マウスの細胞ですか？それとも、ヒトですか？ マウスです。 ○ 同種のフィーダー細胞の上に乗せて起こしてみて下さい。 樹立時からしばしばフィーダーに乗せてます。起こすときも乗せてみましたがだめでした。 ○ それから、起こしてから細胞を入れたインキュベーターに向かって、柏手を三回 うまくいきませんでした。回数を増やすとうまくいくかもしれません(まだ試してません)。 ＜これからしていくこと＞ ○ 遠心なし ○ HEPES ○ 胚の凍結保存液 ○ 文献にさらにあたる ○ PSをぬく ○ 47.5%血清、47.5%コンディションメディウム、5%DMSO ○ DMSOをゆっくり加える ○ 柏手を三回以上

[ここまでの戦況−前半] 削除/引用 No.1954-13 - 2008/09/18 (木) 21:18:51 - ami ○ 遠心なしを試す まだできてません。 ○ HEPESを試す まだできてません。 ○ コラーゲンコートされた皿を使う コラーゲンコートで飼ったら機嫌が悪くなります。再度やってみましたが機嫌が悪くなりました。 ○ 胚の凍結保存液を試してみてはいかがでしょうか。 まだできてません。 ○ 浮遊培養は振倒培養しているのでしょうか？ 振倒してません。 ○ 「Cyrobiology」という雑誌 かなり探しましたが、あまりよい情報はありませんでした。 他の雑誌に検索範囲を広げています。 ○ 起こした後の細胞濃度を濃い目にすると、起きがよくなる場合はあります。 48ウェルなんかでも試していますが、だめです。 ○ また、おおさんの内容とかぶりますが、新しい培地ではなく、コンディションドメディウムで起こすと、改善するかもしれません。 半分コンディションメディウム、全部コンディションメディウムを試しましたがだめです。 ○ PSをぬいてみる。 まだできてません。 ○ 2-メルカプトエタノールをくわえてみる(凍結時、起こした時の培養) 常日頃から加えてます。 ○ DMSOのメーカーをかえてみる。 研究室中のDMSOを試しました。変わりなしです。 ○ 血清のロットをかえてみる。 まだできてませんが、樹立の時にはロットを変えるといまいちでした。 ○ 保存する時の細胞密度をたかくする。 だめでした。 ○ 保存の溶液を47.5%血清、47.5%コンディションメディウム、5%DMSOにする。 95%血清、5%DMSOはだめでした。試してみます。 ○ 理研の細胞銀行に譲ってみる(これは無茶ですね、、、) 凍結しないと譲れない、、、 ○ 細胞を回収する時期を従来のうえつぎの時期より早くする(従来80%コンフのところを50%ぐらいとか) だめでした。

(無題) 削除/引用 No.1954-12 - 2008/09/16 (火) 19:13:58 - EJ マウスの細胞ですか？ それとも、ヒトですか？ その他の動物種？ 同種のフィーダー細胞の上に乗せて起こしてみて下さい。 マウスでBalb/cなら、同じ系統のファイブロとか、腹腔内の細胞とか。 脾臓をバラしてそれを増殖停止させて使うのも有効です時々。 ヒトなら、市販のヒトの初代培養皮膚細胞か、マウスのMEFが使えるかも知れない。 放射線照射か、マイトマイシンC処理で増殖を止めて。 貼り付くか、底面をほぼ一杯に近い状態の密度で、クライオチューブを解凍し、洗浄はお任せしますが、その後加えるだけ。 増殖後は、何かのマーカーで、フィーダーのコンタミの可能性をネグっておいて下さい。 それと、既に出てましたが、クライオチューブ一本を、24ウェルの2ウェルに高密度で撒く。 血球系で寝覚めが悪い奴らにはそれなりに効果的です。 それから、起こしてから細胞を入れたインキュベーターに向かって、柏手を三回（いや冗談です失礼。海外でやるとナニソレ？と、ウケますが。）

(無題) 削除/引用 No.1954-11 - 2008/09/15 (月) 13:19:51 - ats DMSOによる急激な浸透圧ショックが原因かもしれませんね。 氷冷した40%FBS-20%DMSO-40%培地を、同量の氷冷した細胞懸濁液（10%FBS入り培地）に滴下しながら少しずつ5分くらいかけて混合する。クライオチューブに移し、10分ほどで氷冷したのち、凍結操作を行う。DMSOは培養用か超特級グレード（生化学用とか、分光分析用など。４℃凍結保存）を使う。。。では、どうでしょうか。 通常は細胞ペレットを市販の凍結保存液に直接懸濁して凍結していますので、上記方法の有用性は不明です。ご参考になれば。

(無題) 削除/引用 No.1954-10 - 2008/09/15 (月) 04:39:20 - おお また幾らかやけくそで、、、 細胞を回収する時期を従来のうえつぎの時期より早くする(従来80%コンフのところを50%ぐらいとか) 細胞を回収する数時間前にバイチを更新する。 ATCCに細胞を譲る、、、、、あ、しまった。

(無題) 削除/引用 No.1954-9 - 2008/09/14 (日) 17:43:28 - おお ちょっとやけくそ気味な案を並べておきます。 PSをぬいてみる。 2-メルカプトエタノールをくわえてみる(凍結時、起こした時の培養) DMSOのメーカーをかえてみる。 血清のロットをかえてみる。 保存する時の細胞密度をたかくする。 保存の溶液を47.5%血清、47.5%コンディションメディウム、5%DMSOにする。 理研の細胞銀行に譲ってみる(これは無茶ですね、、、) それでうまく行くのかといわれれば、全く自身がありませんし、そんな事をしたこともありませんので気が向いたらということで、、、

(無題) 削除/引用 No.1954-8 - 2008/09/14 (日) 17:13:28 - ~ 起こした後の細胞濃度を濃い目にすると、起きがよくなる場合はあります。 また、おおさんの内容とかぶりますが、新しい培地ではなく、コンディションドメディウムで起こすと、改善するかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1954-7 - 2008/09/14 (日) 16:13:11 - - 作製されたlineはgranule系の細胞でしょうか？ ちょっとググってみたらこんな論文がありました。 Cryobiology Volume 33, Issue 4, August 1996, Pages 391-403 Freezing Injury of Granulocytes during Slow Cooling: Role of the Granules F. Arnaud, H. Yang and L. E. McGann ちらっと見た限り、対処法等は書いてなさそうですが、 何かのヒントになればとおもい、挙げてみました。 でも、「Cyrobiology」というを雑誌の他のペーパーを探してみたら 対処法が載ってるペーパーが見つかるかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.1954-6 - 2008/09/14 (日) 16:11:29 - ~ 胚の凍結保存液を試してみてはいかがでしょうか。 細胞の性質は全く違うでしょうけれども、 胚1個がきちんと起きるように作られていますので、 他の細胞にも使えればいいなと思っています。 (私は試したことはありませんが) 浮遊培養は振倒培養しているのでしょうか？ いきなり振倒培養で起こすよりも、ペトリディッシュなどで揺らさずに起こしたほうが起きがいい細胞はあります。

(無題) 削除/引用 No.1954-5 - 2008/09/14 (日) 15:55:24 - ami > DMSO 5%はATCCのたいていの細胞でそうレコメンデーションされてますのでいいかもしれません。 やってみます。 > コラーゲンとかコートしたディッシュで接着した細胞としてかうと、調子がよくならないかなぁとちょっと思いました。 コラーゲンコートしたディッシュは考えてませんでした。わりあい底に接着する感じの浮遊細胞なので、いいかもしれません。やってみます。 > あとはおこした時だけは20%のFCSのバイチにして、リカバリーをよくするとか、、、、バイチをリッチなものにするとか(IGF, NEAAを加えるとか、、、、、) 起こしたときは20%は試しましたがいまいちでした。いろんなものを入れてみたりしましたがだめでした。 ＜ここまでのまとめ＞ ○ DMSO 5%を試す ○ 遠心なしを試す ○ HEPESを試す ○ コラーゲンコートされた皿を使う

(無題) 削除/引用 No.1954-4 - 2008/09/14 (日) 03:47:22 - おお DMSO 5%はATCCのたいていの細胞でそうレコメンデーションされてますのでいいかもしれません。 コラーゲンとかコートしたディッシュで接着した細胞としてかうと、調子がよくならないかなぁとちょっと思いました。 あとはおこした時だけは20%のFCSのバイチにして、リカバリーをよくするとか、、、、 バイチをリッチなものにするとか(IGF, NEAAを加えるとか、、、、、) 参考になるかどうか分かりませんが思いつくことをかいてみました。

(無題) 削除/引用 No.1954-3 - 2008/09/14 (日) 00:43:36 - ami > DMSOの濃度を5〜7.5％くらいまで下げてみるのが手かな。 DMSO 0%は試してました。それでも一応融解、遠心直後はTrypan blueで見ると生きてました。5%とか試してみます。 > 骨格（核内骨格？）が弱いかなにかのために遠心に弱いという可能性で、これだとすると、急速解凍したあとで培地を5倍くらい加えたままで、遠心除去しないで培養した方がvaibilityが増す場合もあります。 普段の遠心よりゆるゆると遠心してみましたが、だめでした。遠心なしは検討してませんでした。試してみます。 > も一つは、pH変化の可能性、くらいでしょうか。これはHEPESを使えばいいです。 HEPES･･･使い方調べてみます。

(無題) 削除/引用 No.1954-2 - 2008/09/14 (日) 00:31:25 - rei DMSOの濃度を5〜7.5％くらいまで下げてみるのが手かな。後は、骨格（核内骨格？）が弱いかなにかのために遠心に弱いという可能性で、これだとすると、急速解凍したあとで培地を5倍くらい加えたままで、遠心除去しないで培養した方がvaibilityが増す場合もあります。も一つは、pH変化の可能性、くらいでしょうか。これはHEPESを使えばいいです。

どうしてもFreezeできない細胞株 削除/引用 No.1954-1 - 2008/09/13 (土) 21:28:00 - ami お世話になっております。 細胞株を作ったのですがどうしてもFreeze Stockできません。 浮遊細胞です。腫瘍細胞っぽく勝手に増えます。しっかり増殖している時期に凍結してます。 90% 培養に使っているメディウム＋10% DMSO → だめ 90% FCS＋10% DMSO → だめ セルバンカーなど市販の凍結保存液 → だめ フリージングコンテナ(-1℃/minになるやつ)使用 → だめ 遠心で死んでいるということはなさそうです(とはいってもFreezeしてない細胞を同条件で遠心して死なない、というだけですが)。 何か試してみるべきものはありますか、Suggestionください。

全16件 ( 1 〜 16 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---