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返信ありがとうございました。 削除/引用 No.1952-4 - 2008/09/18 (木) 02:29:14 - 30 返事が送れて申し訳ありません。 お二方がおっしゃるように、 鋳型に問題があるように思えます。 プライマーの設計をやり直すよりも、 鋳型のシークエンスや、ＰＣＲ産物のｼｰｸｴﾝｽ結果の 照合に使ったＢＬＡＳＴデータ等、再検討してみようと思います。 また相談するかもしれませんが、 その際はどうぞよろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.1952-3 - 2008/09/13 (土) 18:35:11 - おお >[Re:1] 30さんは書きました : > > そこで質問です。 > プライマーの設計において、 > 端にGGGやAAAなどの連続した配列を付けない方がよい、 > といったことは原理的にありますでしょうか。 特にないと思います。 > > 鋳型としたプラスミドに問題がある可能性と、どちらが高いと > 考えられるでしょうか。 AP様と同様鋳型に問題があるようなきがします。SNPs拾ったんでしょうかね、、、シーケンスしたりして配列を１度確認された方がいいかと思いますが、、、、

(無題) 削除/引用 No.1952-2 - 2008/09/13 (土) 17:10:23 - AP プライマー配列の中ほどで配列が違っている場合は、プライマーの合成エラーだったということが少なからずありますが、3'末端ですので鋳型の配列が本当はggCだったというのが一番ありそうです。校正活性のあるKODなんかだと、3'末端のミスマッチは削られて伸長反応が進みますので。 校正活性のない普通のTaqでPCRのほうが増幅率が高いのが普通ですが、それで増えないならきっとそうでしょう。鋳型のシークエンスをやり直してみるというのももちろんあり。GC-richなので読み間違えているのかも）。

PCR用プライマーについて 削除/引用 No.1952-1 - 2008/09/13 (土) 16:29:58 - 30 いつもお世話になっております。 今回は今使っているプライマーに問題がないかと思い、 質問があります。よろしく御願い致します。 私はプラスミドに乗った遺伝子に関して制限酵素サイトを付加した プライマーを使ってKOD　PCRにかけましてとってきた遺伝子を クローニングしました。 しかし、とってきた遺伝子をシークエンスしますと、 プライマー(27bp)部分に含まれているある特定の一塩基に変異が入っています。 これは、Reverse primerの3´末端において、 　5´GGG　3´→　GGC 本来Gのところが、 Cになっているものです。 これは何度似たようなPCRでとってきても同じで、 これではアミノ酸配列が変化してしまいます。 そこで質問です。 プライマーの設計において、 端にGGGやAAAなどの連続した配列を付けない方がよい、 といったことは原理的にありますでしょうか。 鋳型としたプラスミドに問題がある可能性と、どちらが高いと 考えられるでしょうか。 皆様のお考えを聞けたらありがたいです。 よろしく御願い致します。

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