いつもお世話になっております。
今回は今使っているプライマーに問題がないかと思い、
質問があります。よろしく御願い致します。
私はプラスミドに乗った遺伝子に関して制限酵素サイトを付加した
プライマーを使ってKOD PCRにかけましてとってきた遺伝子を
クローニングしました。
しかし、とってきた遺伝子をシークエンスしますと、
プライマー(27bp)部分に含まれているある特定の一塩基に変異が入っています。
これは、Reverse primerの3´末端において、
5´GGG 3´→ GGC
本来Gのところが、
Cになっているものです。
これは何度似たようなPCRでとってきても同じで、
これではアミノ酸配列が変化してしまいます。
そこで質問です。
プライマーの設計において、
端にGGGやAAAなどの連続した配列を付けない方がよい、
といったことは原理的にありますでしょうか。
鋳型としたプラスミドに問題がある可能性と、どちらが高いと
考えられるでしょうか。
皆様のお考えを聞けたらありがたいです。
よろしく御願い致します。 |
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